統合されたシステムとしての輸送系の例（孔辺細胞） Example of integrated transport systems

1. ２３年度環境応答生理学第３回　（５/９） Physiology of Environmental Responses (Class-3, 2012) 膜輸送（続き：植物栄養）、シグナル伝達、細胞死Membrane transport (cont.), signal trasnmission, and cell death 統合されたシステムとしての輸送系の例（孔辺細胞） Example of integrated transport systems

2. 植物の輸送系：役割と特徴 Role and charactereistics of Plant transport systems • 長距離輸送　　根→道管→茎・葉Long distance transport Root → Xylem → Stem/Leaf • 同化産物（糖など）の移動は・・・ In case of assimilated materials (sugars and others)　　葉緑体→葉の細胞→師管→根・生殖器官 　　　（ソース） （シンク）Chloroplast → Leaf cells (Source) → Phloem → Root/vegetative tissue (Sink) • 細胞レベルでの輸送（膜輸送、小胞輸送） Transport at cellular level (membrane transport, vesicle transport) • 環境変動（不足と過剰）に対応 Responsible to various environments (excess and deficiency)

3. 多種多様な輸送系（とその遺伝子）の存在 Various transport systems (and corresponding genes) • Pump • Transporter • Chanell 208種類 559種類 101種類 シロイヌナズナの場合 (in Arabidopsis) 「植物の膜輸送システム」（秀潤社）より

4. ATP Ion（low concentration） 細胞の構造と無機イオン輸送の関係 (Inorganic) Ion transport and cell structure Nuc Vacuole Exclude Ion Accumulation Isolation Selection

5. Detoxification Compartmentation Tolerant/sensitive determinants and transport system Cell/Individuals • Tolerant？Sensitive？ Tolerant mechanisms: compartmentation, no absorption, exclusion, to be insensitive 標的 Tarｇet Elements （toxic materials） • Sensitive（感受性）： Originally no tolerant mechanism Inactivation of tolerant mechanism→　Disturbance in metabolism and others (Injory mechanism)

6. + + + + + + • - - + + + + + + + + + 「電気化学ポテンシャル」(electrochemical potential)とは 「濃度差と電位差の両方を考慮したもの」(including both gradient of concentration and electric field) 輸送の基本　・・・　濃度勾配（濃度差）Movement ・・・ Gradient (Concentration) • - -(minus charge) 10倍の濃度差と、59mVの電位差がつりあうBalance between 10-hold concentration gradient and 59 mV

7. 電気化学ポテンシャル（の正式） Electrochemical potential (formula) 標準状態の化学ポテンシャル (standard chemical potential)μ* 気体定数 (Gas Constant)R　　絶対温度 (Abs. Temp.)T　　活量 (activity)a 粒子のイオン価 (charge No.)z　　ファラデー定数 (Faraday Const.)F 電位 (electric potential)φ 平衡電位 (Reversal(Equivalent) potential) Em or Erev ネルンストの式:Nernst equation 　膜内外で一価（下図の場合K+）が平衡しているときは・・・ 外側基準 (outer is zero standard) K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ K+ (In case of K+)

8. ADP + Pi エネルギーを直接使って、電気化学ポテンシャル勾配に逆らって、物質を輸送する (Against electrochemical gradient, using energy) ポンプ (Pump) H+ H+ H+ H+ Example: H+ -ATPase H+ 輸送速度は毎秒１０２個 (102 molecules per sec) ATP H+

9. H+ Na+ Na+ H+ ある物質X（たいていH＋）の電気化学ポテンシャル勾配を利用して、目的の物質Yを濃度勾配に逆らって輸送する (Using electrochemical gradient of X (H＋in most case), transporting Y against Y’s electrochemical gradient) トランスポーター (Transporter) Na+ H+ H+ H+ H+ Na+ Na+ Example: Na+-H+ -antiporter Na+ Na+ H+ 輸送速度は毎秒１０3個 (103 molecules per sec)

10. glucose glucose 目的の物質を、電気化学ポテンシャル勾配濃度勾配にしたがって（促進的に）輸送する (Transport X according to its electrochemical gradient) チャネル (channel)一部のトランスポーター　（Some Transporter） K+ glucose K+ K+ K+ K+ • - - - • - - - K+ Example: K+ -channel Example: Glucose transporter 輸送速度は毎秒１０3個 (103 molecules per sec) 輸送速度は毎秒１０8個以上 (108 molecules per sec)

11. ⋍K+の平衡電位 Em of K+ （動物も植物も） 細胞膜電位 （静止電位）Membrane potential (Resting potential) 細胞膜電位　＝　非起電性成分 Membrane potential non-electrogenic ones （細胞内の非移動性負電荷） intracellular immobile negative charges ＋ 起電性成分（起電性ポンプ） electrogenic ones (electrogenic pump) 動物と植物はここが違う！ Plant unique

12. Resting potential of living cells Animal cellsPlant cells Na+-K+-ATPase　（electrogenic pumps）　H+-ATPase -70 ～ -90 mV -100 ～ -200 mV

13. For exclusion of [Na+]cyt ・・・ Na+/H+ antiporter Exclusion of Na+(How to low [Na+]cyt) Plant [Na+]out -freeが基本 No Na+-K+-ATPase except sea algae Animal High[Na+]outが基本 Na+-K+-ATPase 海を捨てた （例外：海産藻類は、持っている）

14. 二次輸送システムの基本的な違い Plant Using H+gradient Animal Using Na+ gradient （例外的に）植物細胞にも存在 Some specially in plant cells

15. 水生巨大藻類：車軸藻（ Characeae）を使ったイオン輸送系の研究 多核巨大節間細胞 (multi nuclei single cell of internodal cells) 　電気生理 (electrophysiology) 細胞手術 (cell operation) 　（イカの軸索神経植物版） 　原形質流動（緑の筋肉） (Cytoplasmic streaming (green muscle))

16. （cell recording） In case of normal plant cells, protoplasts are prepared . 従来の 電気生理 （classical electrophysiology） パッチクランプ Patch Clamp （Single channel recording） １９９１年 ノーベル賞

17. Erev （逆転電位） open ion+ close ↑外向き電流outward current ion+ Outward current ・・・ 　＋ ion efflux （外向きの流れ） 　　または 　－ ion influx（内向きの流れ） ↓内向き電流 inward current

18. Erev tells flux ions and selectivility （１）イオンMの平衡電位（ネルンストの式）と、MがK+の場合 （２）３つの主要イオンで電位が決まる場合のGoldmanの式 （３）Cl－の透過性が低い場合、Na＋とK＋の選択性αが求められる If Cl- permeabiliy (PCl) is low, selectivity between Na＋and K＋ is calculated.

19. 原形質膜 out in K+ Na+ Ca2+ ATP PNa/PK（α）= 0.28 （淡水産車軸藻の場合） Erev （逆転電位） Na+はK+のチャネルを通って細胞に入る [K+]in = 100, [K+]out = 0.1, [Na+]in = 0, [Na+]out = 100 (cyt side is “in”） 耐塩性の高い車軸藻（汽水産）の場合、αはほとんど０、すなわちNa+はK+のチャネル通れず、細胞に入らない (In blackish characae, α ≒０)

20. カリウムチャネルの分子構造Molecular structure of K channel 放線菌のKcsAチャネル Actinomycetes Kcs （現代科学２００４年１月号より） By Mackinonn ２００３年ノーベル賞

21. out in K+ Na+ Arabidopsis HKT Na/K 共輸送 symport 「植物の膜輸送システム」 （秀潤社）より

22. Ｘ Today’s paper （Science 270:1660, 1995） Arabidopsis HKT out in K+ Na+透過に関与するのは A240とL247 Na+ 300 mM NaCl入り培地

23. 別のNa排出システム（ＳＯＳ系）Salt stress sensitivity test／bending assay Sensitive Mutant (SOS mutant) by Dr. Zhu inversion wild type 5-day-old plant without salt stress salt stress for several days

24. SOS1-mutant SOS3 SOS2 K+ Na+ X NHE KAT AKT HKT ・・・ Na+ Na+ H+ SOS1(Na/H antiporter) SOS2: CIPK24 SOS3: CBL4

25. ＡｔＨＫＴ１とＳＯＳ１の植物体内での生理的役割（today’s model）

26. Signal transmissionsSeveral system for salt stress responses Plant use calcium to resolve salt tolerance R.A Bressan, P.M.Hasegawa, J.M.Pardo Trends in plant science, 3:411-412 (1998) ＣＡＭ： cslmodulinePK：Protein Kinase CDPK: Ca-dependent PKPP: Protein PhosphataseＣＮA/B： Calcineurin A/B（ＣBＬ：CNB-like）

27. カルシウムの関係するCBLs/CIPKs系 BlackNumbers: CIPKs Red:CBL9 Blue:CBL1 3, 5, 10 CBL:1～9 （Ｃａｌｕｃｉnｕｌｉｎ-Blike proteins) CIPK1～25 (CBL-interacting protein kinase) 1, 4, 6, 8,18 7, 9 2, 11-17, 19-25 Drought-responsive Cold-responsive Yeast Two-hybrid

28. Figure 1. A schematic presentation of calcineurin to CBL–CIPK: a paradigm shift from animals and fungi to plants. Following Ca2+ signal elicitation, calcineurin B (CNB) and calmodulin (CaM) bind Ca2+ leading to interaction with and activation of calcineurin A (CNA), a protein phosphatase in animals and fungi. Thecalcineurin B-like protein (CBL) in plants recognizes and regulates the activity of CIPK, a protein kinase. Figure 3. A working model of the Ca2+-dependent pathway for potassium (K) channel activation in low-K response. (a) Low K+ concentration triggers increased levels of ROS, which induces Ca2+ fluctuations. Ca2+ binding to CBLs activates the Ca2+ sensors and leads to CBL–CIPK complex formation and targeting of the complex to the plasma membrane. The CIPK kinase domain physically interacts with the C terminus of AKT1, phosphorylates it and activates the channel, resulting in K-uptake into the cell. Reproduced from Ref. [22]. (b) Activation and inactivation of AKT1 by CBL–CIPK and PP2C-type phosphatase AIP1. Reproduced from Ref. [19]. Figure 2. Hypothetical model of alternative targeting of CIPK24/SOS2 to plasma membrane (PM) or tonoplast by CBL4/SOS3 or CBL10. Na+ stress (salt signal) triggers cytosolic Ca2+ elevation that activates CBL4/SOS3 and CBL10. Both of these Ca2+ sensors can interact with CIPK24/SOS2, forming alternative Ca2+-sensor–kinase complexes. The CBL4/SOS3–CIPK24/SOS2 complex targets the PM-localized Na+/H+ exchanger SOS1, whereas the CBL10–CIPK24/SOS2 complex regulates ion transport processes at the vacuolar membrane. The black lines connecting CBL10 to tonoplast and CBL4/SOS3 to PM, respectively, indicate membrane anchors. The question mark indicates a component of unknown identity. Reproduced from Ref. [25]. The CBL–CIPK network in plant calcium Signaling. Sheng Luan Trends in Plant Science Volume 14, Issue 1, 37-42 (2009)

29. カルシウムウェーブ／シグネチャーCalcium wave/signature <Fluo-3> <Fura 2> Ｃａ発光性タンパク:イクオリン (aequorin) • 蛍光試薬を使った例 「植物の生化学・分子生物学」

30. カルシウムの関係するさまざまな系 (Ca-related systems) CDPK and aquaporins カルシウムの細胞内への流入　Ca-influx→　伸展活性化カルシウムチャネル Stretch-activated Ca-channel Aquaporins and waterhomeostasis in plants Kjellbom et al. TIPS, 1999, 4:308 More….→　膜電位依存性カルシウムチャネル（ＴＰＣ１）　　　／非選択性カチオンチャネル（ＮＳＣ）

31. Nuclear PCD “on” 細胞死 (cell death) PCD: Programmed Cell Death Nuclear PCD “off” Pathogenic signal (stress) Physiological signal Tissue homeostasis Removal of damaged cells Morphogenesis Decease (Injury) 「科学」68:223(1998） ｢細胞の持つ自殺機構 アポトーシスを制御する」 (辻本)を改変 apoptosis アポトーシス（≈プログラム細胞死）

32. ↑ もともとの動物細胞での、形態的特徴に基づいたアポトーシス（特徴的な細胞死）の定義(animal cells) 植物でプログラム細胞死が起こる場所／機会 (Tissue and timing in plants) • プログラム細胞死（PCD)発生プログラムに従った、遺伝子や酵素の発現・活性調節を伴った生理的細胞死。シグナル伝達系が関与。 • 植物の場合核とDNA、膜の構造変化はおこるが、動物のアポトーシスに特有な形態変化の多くは見られない。 PCDにつながる細胞内シグナル伝達がある。機能は、かなり動物と共通。遺伝子は、大部分が異なる。

33. オオムギ根での細胞死 　Example in Barley Salt stress-induced cell death高濃度の塩ストレスによる根の伸長成長の停止は細胞核の崩壊を伴う細胞死を引き起こしていた PCD in normal condition • 道管の形成 (xylem) • 破生間隙の形成(aerenchyma) • Control (up) • 500mM NaCl 12 hr (middle) • 500mM NaCl 24 hr (down)

34. Nuclear DNA degradation

35. A model of “point-of-no-return” vａｃｕｏｌｅ nuclease protease ↑ Death Signal nuclear DNA VPEというproteinaseが重要らしい（VPE: Vacuolar Processing Enzyme） (Hatsugai et al. Science 305:855, 2004) 他の”Point-of-no-return”候補：　 （最後の）葉緑体 or ミトコンドリア or リボゾームの消失

36. 次回第４回　５/２３植物の組織の構造と機能の分子生理学 柴坂先生