Genomica e modelli animali di malattie umane

1. I giovedì della cultura scientifica “Etica e sperimentazione animale nella ricerca biomedica” Genomica e modelli animali di malattie umane Mariateresa Mancuso BIOTEC-MED

2. Mus Musculus : organismo modello nella ricerca biomedica Organismo complesso Piccole dimensioni: facile da manipolare, bassi costi di mantenimento Similarità fisiologica e genetica con l’uomo Alto tasso di fertilità: progenie multipla ottenibile ogni 9 settimane

3. Topo Uomo • > 90% di sintenia Cromosomi di topo Cromosomi umani 350 regioni conservate Confronto tra il genoma del topo e dell’uomo • 14% più piccolo (2.5 bilioni di basi versus 2.9) • Entrambi contengono circa 30.000 geni codificanti proteine • 80% dei geni in omologia Il genoma del topo è facilmente manipolabile

4. TOPI INBRED Accoppiamento tra fratello-sorella per 20-30 generazioni successive • 98.6% di omozigosi a tutti i loci • Minima variabilità genetica in una popolazione • Possibilità di fissare uno specifico fenotipo Suscettibilità o resistenza allo sviluppo di tumori spontanei

5. Selezione genetica delle linee Car-S e Car-R D B A / 2 A SJL P SWR C B A B A L B / c C 5 7 B L / 6 F 1 F 1 F 1 F 1 F 2 F 2 F0 DMBA-TPA - DMBA-TPA - Basse dosi Alte dosi ) C a r - S ( F 1 9 C a r - R ( F 1 6 ) La suscettibilità e/o la resistenza all’insorgenza di un particolare tumore può essere ottenuta tramite un programma di accoppiamento selettivo bidirezionale mediante applicazione di un protocollo di cancerogenesi chimica a due stadi Differenza in termini di suscettibilità > di 100 volte Alcuni geni coinvolti nella suscettibilità e nella resistenza sono stati identificati

6. Topi Min (Multiple intestinal neoplasia) Topi Min (Multiple intestinal neoplasia) Ottenuti mediante mutagenesi germinale con ENU Ottenuti mediante mutagenesi germinale con ENU C57Bl/6 C57Bl/6 Adenocarcinomi intestinali Adenocarcinomi intestinali Fenotipo primario trasmesso alla progenie Fenotipo primario trasmesso alla progenie Poliposi adenomatosa familiare Mutazione eterozigote del gene APC (oncosoppressore) Poliposi adenomatosa familiare Mutazione eterozigote del gene APC (oncosoppressore) Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino Apc Ch18. Mutazione non-senso nel codone 850 del gene murino Apc Mutazione Min Mutazione Min …primi tentativi di manipolazione genetica del genoma murino Mutazioni multiple casuali introdotte nella linea germinale mediante l’utilizzo di cancerogeni chimici permettono di identificare singole mutazioni responsabili dell’insorgenza di un determinato fenotipo Primo modello animale utilizzato per studi quantitativi e meccanicistici dell’induzione di neoplasie intestinali

7. Lo sviluppo delle nuove metodologie per manipolare il genoma murino ha rivoluzionato la capacità di generare modelli animali di malattie umane Animali geneticamente modificati Transgenici patologie dovute ad alterazione di funzione Knockout patologie dovute ad assenza di funzione • Impossibilità di controllare i geni bersaglio da modificare • Necessità di vasti programmi di allevamento • Difficoltà di identificare i fenotipi recessivi

8. TOPI TRANSGENICI Patologie dovute ad alterazione di funzione Microiniezione ATG Promotore Gene/cDNA di interesse P(A) Femmina balia Analisi del DNA In grado di trasmettere il carattere per via ereditaria Possono differire per numero di copie inserite (2-50) Effetto posizionale Alterazione dell’espressione di un gene endogeno Il modello che meglio rappresenta la malattia umana deve essere selezionato osservando la progenie di vari topi fondatori TOPI FONDATORI

9. TOPI KNOCKOUT Patologie dovute ad assenza di funzione Ricombinazione Elettropolazione Costrutto Cellule ES Cellula ES con un gene mutato Neo Microiniezione Knockout omozigote (-/-) Chimera Impianto in una femmina balia Knockout eterozigote (+/-) Selezione delle cellule KO mediante trattamento con la neomicina L’assenza di funzione di un gene è spesso incompatibile con la vita

10. Studiare gli stadi precoci prima della comparsa dei sintomi • Possibilità di individuare in vivo i bersagli di farmaci in via • di sperimentazione La speranza è che il topo mutante esibisca sintomi simili ai soggetti umani e che la patogenesi sia simile in entrambe le specie

11. Sono centinaia i modelli animali di malattie umane a carattere monogenico attualmente disponibili

12. Ptch1 +/- BASALIOMA Ptch1 -/- letale fenocopia della sindrome di Gorlin RI Malattia ereditaria autosomica dominante con una incidenza stimata pari a 1/50.000-150.000. Difetto costituzionale in una delle due copie di un gene soppressore tumorale (Patched1) SINDROME DI GORLIN Numerose anomalie nello sviluppo Ritardo mentale Crescita eccessiva del corpo Medulloblastoma(10%) Sarcomi Fibromi ovarici Basalioma (dopo irraggiamento) Predisposizione alla tumorigenesi spontanea e radioindotta • Identificazione e caratterizzazione molecolare delle lesioni preneoplastiche • Dipendenza dall’età al momento dell’irraggiamento • Possibilità di identificare la cellula bersaglio • Sperimentare terapie farmacologiche e geniche MEDULLOBLASTOMA

13. Cre è una ricombinasi sito-specifica che riconosce la sequenza lox P del fago P1. Quando due siti lox P vengono inseriti nel DNA, la proteina Cre promuove la rimozione del frammento di DNA compreso tra i lox P. Incrociando un topo che porta il gene di interesse, fiancheggiato da due sequenze lox P, con uno in cui il gene Cre si trova sotto il controllo di un promotore tessuto-specifico, si ottiene un organismo in cui il gene verrà rimosso solo nelle cellule che esprimono Cre. TOPI KNOCKOUT CONDIZIONALI: il sistema Cre/lox P Questa strategia viene utilizzata per produrre modelli knockout condizionali in cui è possibile accendere o spegnere l’espressione di un gene in un determinato tipo cellulare. Estremamente vantaggiosa quando sono coinvolti geni la cui mutazione risulterebbe letale.

14. MUTANTI CONDIZIONALI PER LO STUDIO DEL TUMORE MAMMARIO Nel 50% dei casi di tumore mammario familiare sono state riscontrate mutazioni del gene Brca1. La mancanza di Brca1 causa una precoce mortalità embrionale Mutante condizionale in cui si determina la rimozione dell’esone 11 di Brca1 solo nelle cellule epiteliali del tessuto mammario Bassa frequenza Lunga latenza Tumore mammario Quali altri geni sono coinvolti nello sviluppo del tumore mammario ? Mutanti condizionali per Brca1 e p53 +/- : il 73% sviluppa il tumore La perdita di p53 accelera lo sviluppo tumorale delle ghiandole mammarie di topi che presentano una specifica delezione di Brca1

15. Ci permettono di studiare la malattia in numerosi individui con un background omogeneo. • La progressione della malattia può essere seguita in ambiente altamente controllato • Anche quando il modello animale non ricapitola pienamente la malattia umana, può comunque fornire importanti indicazioni delle differenze interspecifiche e della suscettibilità individuale • Disporre di un modello animale premette di testare l’azione di nuovi farmaci e pone le basi per una possibile terapia genica Come fareste senza di me? CONCLUSIONI Malattie a carattere poligenico: obiettivo primario nel futuro della ricerca biomedica