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Testes utilizados em Imunologia Clínica – Testes de Reagentes Marcados Profa Alessandra Xavier Pardini Imunologia Clínica. Alta sensibilidade Boa especificidade Direta – detecção de Ag Indireta – detecção de Ac Competição – amostra compete com reagente marcado
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Testes utilizadosem ImunologiaClínica – Testes de ReagentesMarcados Profa Alessandra Xavier Pardini ImunologiaClínica
Alta sensibilidade Boa especificidade Direta – detecção de Ag Indireta – detecção de Ac Competição – amostra compete com reagentemarcado Customais alto – produção dos reagentes Permitemautomaçãocompletaounão Permitedetectar Ac de umaclasseespecíficaquesejamespecíficospara um determinado Ag Reagentemarcado – Ag ou Ac Sistemaheterogêneo – lavagem – retirareagentenãoligado
Reagentemarcado - Marcaçãonãomodificainteração Ag-Ac - Alto custo - Permitedetecção de classes específicas de Ac para um determinado Ag - Tipo de marcadordeterminanome do teste MARCADOR Radioisótopo = RADIOIMUNOENSAIO Fluorocromo = IMUNOFLUORESCÊNCIA Enzima = ELISA, IMUNO-DOT, WESTERN BLOT
Radioimunoensaio - Primeiratécnica com reagentemarcado • desenvolvidoem 1956 – detecção de Ac anti-insulinaempacientestratados com o hormônio - radioisótopos - I125 ou I131 – ligação a resíduos de tirosinaemproteínas - vantagens: quantitativo, rapidez, precisão, limiar de detecçãoemnanooupicogramas - desvantagens: alto custo do teste, vidamédia dos reagentes e riscooperacional – radiosótopos - Uso: Ag e Ac, marcadorestumorais, hormônios
Princípio quantidade de reagente marcado (radioativo) quantifica o Ag ou Ac não marcado presente na amostra através de ligação específica medida da resposta - contagem radioativa - tipo de radiação emitida - radiações e - contador de cintilação - radiação - contador gama de cristal sólido Realizado em 3 estágios Estágio 1 – construção da curva de calibração – diluição seriada do padrão Estágio 2 – interpolação dos resultados Estágio 3 – controle de qualidade (amostras com [ ] conhecida)
Ac + traçador + Ag da amostra PEG carbono interferente: fração não ligada Deve-se realizar a remoção da fração não ligada ou adotar sistema com fase sólida - Fase sólida – matrizes particuladas (celulose e agarose) ou superfície contínua (tubos, discos e placas)
Contador de radiaçãogama cintiladores
Princípio: Baseia-se nacapacidade das moléculas de anticorpo se ligaremcovalentemente a fluorocromossemperdersuareatividadeespecífica com o antígeno.
Fluorocromos - São substânciasque, absorvemluz de um comprimento de ondamenorquandoexcitados com luz UV, emitemluzemcomprimento de ondamaior (fluorescência). - Características: estabilidade, grandecapacidade de absorção, absorção e fluorescência de luz no espectrovisível, nenhumainterferência com a reaçãoimunológica.
Ac + fluorocromos - reatividade específica com o Ag Excitação (nm) Emissão (nm) Fluoresceína FTIC 495 524 Texas Red 595 620 R-ficoeritrina 565 574 - desvantagens: custo do equipamento, sensibilidade limitada, dificuldade de automação - vantagens: específica e reprodutível - tipos – direta, indireta e citometria de fluxo
Cuidados: - padronização adequada do conjugado fluorescente (titulação) - treinamento do pessoal que realizará a leitura, sendo subjetiva, deve ser padronizada para evitar erros que super ou subestimem a fluorescência
Reagentesnecessários Ac marcados – altaespecificidade – polioumonoclonais Ag ouamostrasfixasemlâmina de vidro Glicerinaalcalina – pH 8,5 – montagemda com lamínulas – melhoram a intensidadedaemissão de fluorescência Azul de Evans ouvermelho Congo – corantes de fundo – melhoram a visualizaçãodafluorescência Lâmina de sílicanãofluorescente e de espessuramínima
São fatores que interferem na imunofluorescência: - a qualidade do vidro/lâmina/lamínula - qualidade e tratamento dos Ag fixados antigenicidade e acessibilidade - temperaturas e tempo de incubação - lavagens adequadas - montagem da preparação em glicerina alcalina - microscópio perfeitamente calibrado e limpo - corantes: diminuem a coloração de fundo, facilitando a leitura da fluorescência (azul de Evans)
Microscópio - fonte de luz de alta intensidade • lâmpada de mercúrio ou halogênio • filtros de excitação (ativam a fluorescência) • filtros de barreira (remover interferentes) • microscópios de transiluminação • microscópios de epiiluiminação (apresentam a vantagem de combinar a luz transmitida para exame de contraste de fase, análise da amostra em diferentes comprimentos de onda, no caso de utilização de mais de um fluorocromo) (a luz UV não tem chance de atravessar a ocular)
câmera Fonte de luz branca Fluorescência emitida Filtro de emissão Filtro de excitação Fibra óptica Fibra óptica lâmina Microscópio de imunofluorescência com epiluminação
Reação de Imunofluorescência Reação de Imunofluorescênciadireta Reação de Imunofluorescênciaindireta Reação de Imunofluorescência de captura Reação de Imunofluorescênciaamplificada com complemento Reação de Imunofluorescênciaamplificada com sistemaavidina-biotina
Conjugado fluorescente célula Imunofluorescênciadireta Conjugado - Ac marcado com fluorocromo Vantagens: altasensibilidade e especificidade, possibilidade de localizarcomponentesintracelulares com fluorocromoscontrastantes Desvantagens: um conjugadoparacada Ag Uso: imunohistoquímica – doençasrenais e de pele
Adenocarcinoma de glândulasalivarhumana diiodeto de propídio ITCF http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/adenocarcinomahumansmall.html
Linfócitosinfectados com HIV ITCF http://www.olympusmicro.com/galleries/fluorescence/pages/hivinfectedcellssmall.html
Imunofluorescênciaindireta - Conjugado Ac antiimunoglobulinaespecífico – classes - Diluiçõesseriadas – título de Ac – máximadiluiçãoondeháfluorescência - Vantagens: sensível, específica, reprodutível , fácil, padronizada, mesmoconjugadodetermina Ac produzidosemdiferentesdoenças - Desvantagens: custo do microscópio, subjetividadenaleitura e dificuldade de automação
Anticorpo primário Conjugado fluoresncente Citosol Uso: detecção de Ac paraTreponemapallidum (FTA-ABS), Toxoplasmagondii, vírusdarubéola, citomegalovírus, vírus herpes simples, Trypanosomacruzi, Plasmodium falciparum, auto-anticorpos.
Anticorpo Reação primária Antígeno lavagem Conjugado Anticorpo FITC Reação secundária lavagem Microscópio de fluorescência
Citometria de fluxo Princípio: análise individual e simultânea de componentescelularesatravésdamedição do desvio de luzincidentesobreumacélula e de sinaisfluorescentesemitidospelamesma Vantagens: permitedetecção do tamanhorelativodacélula, suagranulação e de 2 a 7 emissõesfluorescentesdiferentesemmilhares de célulasporsegundo Desvantagens: alto custo, necessidade de treinamento Váriosfluorocromos Uso: imunofenotipagem de linfócitos do sangueperiférico de pacientesinfectadospelo HIV, diagnóstico e prognóstico de leucemias
Conjugado fluorescente Suspensão de mistura de células Feixe de laser Detector Defletor Células fluorescentes Células não- fluorescentes
Espalhamento de luzincidentepode ser de 2 tipos: • - baixoângulo de dispersão – tamanho das células • - ângulo de dispersão de 90o – granulação das células • Fluorescênciaemitidaporcadafluorocromo é detectadaporfotodetectores e convertidaemsinaisprocessados, quantificados e analisadospor um computador • Sinais de luzemitidospelosfluorocromossãodetectadaspor um sistema de canais, originadohistogramas
Técnicasimunoenzimáticas - Ac ou Ag marcados com enzimas – conjugado ENZIMA - elevadaespecificidade - fácil de ser obtidana forma purificada - conjugação a Ag e Ac – seminterferências - produto de reação com substrato – fácil de ser quantificado, mesmo com pequenasquantidades de enzima - estável - custoacessível - váriostipos – fosfatasealcalina, peroxidase - determina o tipo de substrato
Substrato Produto colorido solúvel ou insolúvel SUBSTRATO CROMOGÊNICO - aoseremconsumidosporenzimasgeramprodutoscoloridossolúveisouinsolúveis - quantificação do produto – espectrofotômetro, cor visual oucomparação com padrão - depende do tipodaenzimautilizada
enzima substrato cromógeno cor nm Peroxidase H2O2 OPD, TMB DAB, 4CN laranja, azul marrom, violeta 492 Fosfatase alcalina P-NFF 5-B-4-C-3-IF amarelo lilás 450 PEROXIDASE - substrato H2O2 ligado a um cromógeno - cromógeno com produtosolúvel - OPD ou TMB - cromógeno com produtoinsolúvel - DAB ou 4-cloro-1-naftol FOSFATASE ALCALINA - cromógeno com produtosolúvel - NPP - cromógeno com produtoinsolúvel – BCIP ou NBT
excitação Emissão Fluorescência SUBSTRATO FLUORIGÊNICOS - emitem luz fluorescente após serem consumidos pela enzima - quantificação da luz emitida pelo produto - fluorômetro FOSFATASE ALCALINA - 4-metilumbeliferil-fosfato que gera um fluoróforo (4-metilumbeliferona)
luminol brilho SUBSTRATO QUIMILUMINESCENTE - amplificação de sinal hormônios e marcadorestumorais - emitembrilhoapósseremconsumidospelaenzima - quantificação do brilhoemitidopeloproduto - luminômetro FOSFATASE ALCALINA - adamantildioexietano-fosfatoquegera um ânion (adamantildioexietano)
Ensaioheterogêneo - etapa de lavagem – retirareagentemarcadonãoligado a fasesólida FASE SÓLIDA - conhecidocomosuporte - tubos, microplacas, micropartículasoutiras - partículas de agarose, poliacrilamida, dextran, poliestireno - micropartículas – lavagem – decantação, centrifugação, adsorçãoemfibra de vidrooucaptura - tipos: ELISA, dot – ELISA, IMUNNOBLOT
Immuno-Dot Variação do ELISA conhecidacomo Dot-ELISA fasesólida - membrana de nitrocelulose, PVDF ounáilon substratocromógeno – forma produtoestável e insolúvel – mancha (dot) pode-se usarconjugadoradiativo – detecçãopor auto-radiografia Vantagens: pequeno volume de amostra, testerápido, com sensibilidade e especificidade boas Uso: emergência com suspeita de HIV e estudosepidemiológicos
Colocar as amostras e os controles nos pocinhos da fileira A Colocar o pente na fileira A e incubar segundo as instruções Fracione o pente de acordo com o número de amostras Colocar o pente na fileira B e incubar Incubar nas fileiras C, D e E. Reação com substrato na fileira F Ler os resultados e comparar com o padrão
ELISA - capaz de detectar < [ ] Ag e Ac reagenteligado a umaenzima imobilizaçãoemfasesólida placa de ploiestireno Vantagens: > sensibilidade e especificidade, rapidez, baixocusto e adaptação a diferentesgraus de automação tipos: direta, indireta, de captura e de competição Uso: detecção de Ac paradiversasdoenças e Ag comopartículasvirais, hormônios, proteínastumorais e interleucinas
Determinação de Ag ELISA direto de captura ELISA direto de competição Determinação de Ac ELISA indireto ELISA indireto de captura ELISA indireto de competição
Lavagem Incubação Incubação Adição do substrato, revelação e leitura Ag na amostra Ac fixado na placa Conjugado Ac marcado ELISA direto de captura conhecidocomosanduíche Após a adição de um reagente, realiza-se etapa de lavagempararetirareagentenãoligado Vantagens: Desvantagens: Uso: