酶联免疫吸附实验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)

酶联免疫吸附实验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA) ——检测乙肝表面抗原

实验目的要求 • 掌握ELISA的基本原理 • 掌握ELISA双抗体夹心法检测HBsAg的原理、操作方法及结果判断 • 熟悉表面抗原检测的临床意义

（一）ELISA的原理 ELISA的基本原理三种必要的试剂： • ①固相的抗原或抗体，即“免疫吸附剂” （immunosorbent） • ②酶标记的抗原或抗体，称为"结合物"（conjugate） • ③酶作用的底物

在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。 • 用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。 • 再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。

加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。 • 由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

（二）方法类型及反应原理 • 双抗体夹心法 • 间接法 • 竞争法 • 捕获法

1 双抗体夹心法 ——是检测抗原最常用的方法

操作步骤 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物，洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。

应用 • 此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等 • 不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。

2 间接法 ——是检测抗体常用的方法

基本步骤 1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。 3）加酶标抗抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 4）加底物显色。

应用 • 检测Ab的最常用的方法 • 只要更换不同的固相Ag，可以用一种酶标二抗检测各种与Ag相应的Ab。

3 竞争法

其原理为标本中的抗体和一定量的酶标抗体竞争与固相抗原结合。标本中抗体量越多，结合在固相上的酶标抗体愈少，因此阳性反应呈色浅于阴性反应。 • 方法相同

ELISA的基本步骤 • 包被—洗涤—封闭—洗涤—加样—加酶结合物—洗涤—加底物、显色剂—终止液—酶标仪检测

结果判断 • 定性测定对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出“有”或“无”的简单回答，分别用“阳性”、“阴性”表示 • 定量测定在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线，根据标准曲线得到样品中待测抗原的量。

预期结果 • 阳性：显色为黄色 • 阴性：无色 1 2 3 4 阴性阴性阳性阳性

试剂盒的组成 完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中）参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）显色液（8）酶反应终止液。

本次实验内容 • 乙肝表面抗原的检测 • 具体操作见说明书

乙肝相关知识 • 慢性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（HBV）引起的慢性、传染性疾病，严重危害健康，影响生活质量。 • 1.乙肝的流行病学全世界半数以上的人被感染过，5％为慢性感染，每年有5000万新感染，100万死亡。我国有9.8％HBsAg（＋），慢性达1000万，60％人群感染。

2.传播途径 • 传染源：HBV携带者、乙肝患者血液、体液（精液、阴道分泌物、唾液） • 传播途径：血液、血制品、性、垂直、日常密切接触 • 易感人群：母亲是HBV感染的婴儿、HBV感染家庭成员、吸毒者、性病病人、血透病人、部分医护人员

4.乙肝病毒的形态结构、基因组的特点 • HBV颗粒：小球形颗粒（无病毒核酸，无感染性）——病毒颗粒包膜产生过剩 • 管形颗粒（小球颗粒连接而成） • Dane颗粒（具有感染性的完整颗粒） • 基因：已知DNA病毒中颗粒最小的，带有部分单链区的双链DNA基因组高度压缩、重复利用，容易变异。

5.乙肝的发病机理 • HBV不引起直接肝细胞病变，病毒整合到肝细胞复制，表达肝细胞表面，免疫系统清除。如免疫力强，临床经过为急性肝炎；如免疫力低下，临床经过为慢性肝炎；如免疫耐受，则和机体和平共处，为病毒携带者。

6.治疗 • 急性：早发现早治疗，对症支持治疗。 • 慢性：抗病毒，免疫调节，对症治疗，心理治疗。其中抗病毒治疗最为关键，可延缓肝硬化、肝癌病情的演化和发展。

两对半：乙肝病毒的抗原抗体共有三个系统，但因核心抗原（HBcAg）在血清中一般不易检出，仅其余两对半在血液中可检测出，故俗称“两对半”，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，为HBV感染依据，间接判断病人感染状态。两对半：乙肝病毒的抗原抗体共有三个系统，但因核心抗原（HBcAg）在血清中一般不易检出，仅其余两对半在血液中可检测出，故俗称“两对半”，即HBsAg、HBsAb、HBeAg、HBeAb、HBcAb，为HBV感染依据，间接判断病人感染状态。

思考题 • 本实验所用的底物是什么？ • 简述ELISA原理及ELISA双抗体夹心法测乙肝表面抗原的原理。

酶联免疫吸附实验 (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay,ELISA)