Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen

1. Erstellen von stabilen in vitro Zell-Expressionssystemen Zellen bilden gewünschtes Protein (z.B. ein Transporterprotein) Transfektion oder Infektion der Zielzelle mit dem Gen of interest (GI) Selektion und Isolation der erfolgreich transfizierten Zellen GI GI GI Zielzellen in Kulturschale

2. in-vitro Testung der Influx-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen • Lyse der Zellen • Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen. • Zugabe von Substrat • transfizierte Zellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist, Kontrollzellen nicht oder deutlich weniger, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird • Abwaschen des nicht aufgenommenen Substrates Stabil transfizierte Zellen Nicht transfizierte Kontrollzellen

3. in-vitro Testung der Transporterinhibition von endogen exprimierenden oder stabil transfizierten Zellen • Inhibitor zu den den zu untersuchenden Transporter exprimierenden Zellen geben, Kontrollzellen ohne Inhibitor • Inhibitor lagert sich an Transporter an • Abwaschen des überschüssigen Inhibitors • Zugabe von Substrat • Kontrollzellen nehmen Substrat auf, wenn Substrat transporterspezifisch ist. Die inhibierten Zellen nehmen weniger oder kein Substrat auf, da der Transporter blockiert ist • Abwaschen des überschüssigen Substrates • Lyse der Zellen • Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen inhibierten Zellen und Kontrollzellen. Kontrollzellen

4. in-vitro Testung der Efflux-Transporterfunktion von stabil transfizierten Zellen gegenüber nicht transfizierten Zellen • Zellen lysieren • Membranen isolieren • ggfs. apikale und balolaterale Membranen trennen • Membranen bilden inside-out-Vesikel, d.h. die inneren Membranbestandteile liegen außen und umgekehrt • Zugabe von Substrat • Abwaschendes nicht aufgenommenen Substrates • Homogenisieren der Vesikel • Substrat gelangt über Efflux-Transporter in das Innere der Vesikel über Membranen der transfizierten Zellen, wenn Substrat transporterspezifisch ist, die Vesikel der Membranen der Kontrollzellen nehmen kein Substrat oder nur wenig auf, da der Transporter fehlt oder nur gering exprimiert wird • Konzentrationsbestimmung des Substrates mittels LC-MS/MS oder Elisa bei nicht radioaktiv markierten Substraten oder β-counter bei radioaktiv markierten Proben. Nach Gesamtproteinbestimmung Vergleich zwischen stabil transfizierten und nicht transfizierten Zellen. Stabil transfizierte Zellen Nicht transfizierte Kontrollzellen