М.С.Гельфанд ( ИППИ РАН ) 3-й съезд ВОГиС, Москва, июнь 2004

1. Сравнительная геномика и метаболическая реконструкция: что можно сказать об организме, зная только его геном М.С.Гельфанд (ИППИ РАН) 3-й съезд ВОГиС, Москва, июнь 2004

2. красный: статьисиний: последовательности

3. Анализ индивидуальных генов • Поиск родственных белков в банках последовательностей – перенос функции от гомологов • Функциональные сайты (каталитические центры) • Функциональные участки (трансмембранные сегменты, сигнальные пептиды и т.п.)

4. Анализ на уровне индивидуальных генов даёт возможность охарактеризовать 50-75% генов в новом геноме Но: • ~100универсально отсутствующих генов (нет ни одного известного гена для известной функции) • множество функций, для которых неизвестны представители в больших таксонах • в каждом геноме ~5-10% консервативных генов с неизвестной функцией • трудно предсказывать специфичность в мультигенных семействах (транспортёры, факторы транскрипции) • нельзя найти что-то принципиально новое

5. Полные геномы

6. Сравнительная геномика и метаболическая реконструкция

7. Утилизация пектина E. chrysanthemi

8. … и транспорт олигогалактуронатов E. chrysanthemi Y. pestis K. pneumoniae

9. предсказание и подтверждение

10. Новые члены регулона KdgR у E. chrysanthemi +ppsAфосфоенолпируват-синтаза +ydiA – chmXхемотаксис (акцептор метила) – dhfXпериплазматическая эстераза – spiXизомераза (аналог KduI) –yjgK участвует в нижней части пути – tpfX – ydiVтранспортер – sotAэкспорт сахаров (токсичных интермедиатов?) – gntDBMNACABC-транспортер –yeeOтранспортер

11. YpaA: транспортёр рибофлавина • 5 предсказанных ТМ-сегментов => потенциальный транспортёр • регуляторный RFN-элемент => ко-регуляция с генами метаболизма рибофлавина => транспорт рибофлавина или предшественника • S. pyogenes, E. faecalis, Listeria: естьypaA, нет генов биосинтеза рибофлавина => транспорт рибофлавина Предсказание: YpaA – рибофлавиновый транспортёр (Gelfand et al., 1999) Проверка: • YpaA переносит рибофлавин (генетический анализ, Кренева и др., 2000) • ypaAрегулируется рибофлавином (анализ экспрессии на микрочипах, Lee et al., 2001; прямой эксперимент,Winkler et al., 2002).

12. S-box (rectangle frame)MetJ (circle frame)LYS-element (circles)Tyr-T-box (rectangles) Новое семейство транспортёров аминокислот malate/lactate

13. Метаболическая реконструкция пути биосинтеза лизина

14. Идентификация пути ацетилированных интермедиатов вB. subtilisи родственных бактериях - 0 dapD (yquQ): • ортолог известного гена E. coli

15. Идентификация пути ацетилированных интермедиатов вB. subtilisи родственных бактериях - 1 patA: • пиридоксаль-фосфат-зависимая аминотрансфераза (по гомологии) • ко-локализуется и ко-регулируется с генами биосинтеза лизина во многих грам-положительных бактериях

16. Идентификация пути ацетилированных интермедиатов вB. subtilisи родственных бактериях - 2 ykuR: • N-ацил-L-аминокислота амидогидролаза (по гомологии) • ко-локализуется и ко-регулируется с геном биосинтеза лизина dapD во многих грам-положительных бактериях • в некоторых случаях принадлежит к большому лизиновому оперону, регулируемому LYS-элементом

17. Идентификация пути ацетилированных интермедиатов вB. subtilisи родственных бактериях - 3 dapX: • dapFотсутствует у некоторых бактерий (Staphylococcus aureus, Oenococcus oeni, Leuconostoc mesenteroides) • во всех этих геномах есть dapX, гомологичный аланиновой рацемазе и другим эпимеразам • в S. aureusdapXпринадлежит к большому лизиновому оперону • в O. oeniоперонdapX-asdрегулируется LYS-элемен dapX том

18. Метаболическая реконструкция пути биосинтеза кобаламина (витамина В12) идентификация новых ферментов, транспортёров кобаламина, промежуточных продуктов и кобальта

19. Предсказания: ферменты • синтез жирных кислот: FadR • синтез тиамина: ThiN • биосинтез лизина – путь ацетилированных интермедиатов • обратный путь синтеза цистеина из метионина и путь ре-утилизации метионина • биосинтез кобаламина: ChlID, BluB, PduO, PduX, CobY, CobZ, CblXY, CblZ, BhiB, BtuS • пути катаболизма различных сахаров и олигосахаридов • синтез триптофана и фолата: семейство TrpG/PabA • биосинтез биотина: BioZ, BioK

20. аминокислоты метионин тирозин триптофан лизин аргинин гистидин нуклеотиды сахара и олигосахариды в том числе, важные для патогенеза (стрептококки, растительные патогены) металлы железо цинк кобальт никель витамины и их предшественники биотин тиамин (В1) рибофлавин (В2) кобаламин (В12) Предсказания: транспортёры

21. Предсказания: регуляторные сигналы • MtaR (метиониновый репрессор стрептококков) • BioR (биотиновый репрессор – бактерии и археи) • ZUR и AdcR (цинковые репрессоры) • регуляция катаболизма сахаров и олигосахаридов (несколько десятков регуляторов) • регуляция синтеза ароматических аминокислот (стрептококки) • регуляция систем ответа на перенаселение (quorum sensing – лактококки и лактобациллы) • РНКовые переключатели (рибофлавин, тиамин) • аттенюаторы аминокислотных оперонов • регуляторные системы архей (тепловой шок, пурины, утилизация азота, синтез триптофана)

22. Подтверждённые предсказания

23. Сравнительная геномика систем утилизации цинка Две роли цинка в бактериях: • Структурная в ДНК-полимеразах, праймазах, рибосомных белках • Каталитическая в протеазах и других белках

24. Геномы и регуляторы nZURFUR family ??? pZURFUR family AdcR ?MarR family

25. nZUR- nZUR- Регуляторы и сигналы GAAATGTTATANTATAACATTTC GATATGTTATAACATATC GTAATGTAATAACATTAC TTAACYRGTTAA pZUR AdcR TAAATCGTAATNATTACGATTTA

26. Выравнивание сигналов nZUR GTAATGTAA TAACATTAC (alpha – most genera) GATATGTTA TAACATATC (alpha – Rhodobacter) GAAATGTTATANTATAACATTTC (gamma) GaaATGTtA-----TAACATttC (consensus of consensi)

27. Транспортеры • Ортологи транспортных систем AdcABC и YciC • Паралоги компонентов систем AdcABC и YciC • Потенциальные транспортеры с ранее не известной специфичностью

28. zinT: регуляция zinTрегулируется цинковыми репрессорами (nZUR-, nZUR-, pZUR) zinTодиночный E. coli, S. typhi, K. pneumoniae Gamma-proteobacteria A. tumefaciens, R. sphaeroides Alpha-proteobacteria B. subtilis, S. aureus S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes, L. lactis, E. faecalis Bacillus group Streptococcus group домен:adcA-zinT adcA-zinTрегулируется цинковыми репрессорами (pZUR, AdcR) (ex. L.l.)

29. ZinT: анализ белковой последовательности TM Zn AdcA Y. pestis, V. cholerae, B. halodurans ZinT S. aureus, E. faecalis, S. pneumoniae, S. mutans, S. pyogenes E. coli, S. typhi, K. pneumoniae, A. tumefaciens, R. sphaeroides, B. subtilis L. lactis

30. ZinT: резюме • ZinT часто является доменом цинкового транспортёра • zinTэкспрессируется при недостатке цинка • ZinT локализован на поверхности клетки (имеет трансмембранный якорь) • ZinT имеет цинк-связывающий домен вывод: • ZinT – новый тип цинк-связывающей компоненты ABC транспортёра

31. lmb phtD регуляция цинком показана экспериментально Регуляция белков PHT (pneumococcal histidine triad) в стрептококках S. pneumoniae S. pyogenes S. equi S. agalactiae phtE lmb phtD lmb phtD phtA phtB phtY

32. Структурные свойства белков PHT • Белки PHT содержат множественные копии мотиваHxxHxH • Белки PHT из S. pneumoniae– это паралогис уровнем сходства 65-95% • Белки PHT имеют N-концевые гидрофобные пептиды • Локализация белков PHT изS. pneumoniaeна поверхности бактериальной клеткибыла показана проточной цитометрией

33. Белки PHT: • экспрессируются в условиях недостатка цинка • локализуются на поверхности клеточной мембраны • содержат цинк-связывающие мотивы Гипотеза: • это новое семейство транспортёров цинка

34. цинк-связывающие мотивы в транспортёрах: EEEHEEHDHGEHEHSH HSHEEHGHEEDDHDHSH EEHGHEEDDHHHHHDED DEHGEGHEEEHGHEH (гистидин-аспартат-глутамат) гистидиновые триады в белках PHT: HGDHYHY 7 out of 21 HGDHYHF 2 out of 21 HGNHYHF 2 out of 21 HYDHYHN 2 out of 21 HMTHSHW 2 out of 21 (специфическое расположение гистидинов и ароматических аминокислот) … неверно

35. HDYNHNHTYEDEEGH AHEHRDKDDHDHEHED LRR IR PHT internalin H-rich … продолжение анализа • ГенphtDвходит в оперон с геномlmbво всех стрептококках • Lmb: адгезин, участвующий в связывании стрептококков с эпителиальными клетками • PhtY вS. pyogenes: • phtYрегулируется AdcR • PhtY состоит из трех доменов: 4 HIS TRIADS

36. Белки PHТ: вторая попытка • белки PHT продуцируются при недостатке цинка • белки PHT локализуются на поверхности клетки • белки PHT содержат цинк-связывающие мотивы • phtDобразует потенциальный оперонс геном адгезина • PhtY содержит доменинтерналинаотвечающий за инвазию Гипотеза Белки PHT – этоадгезинысвязанные с прикреплением к клетке хозяина для дальнейшей инвазии

37. Цинк ипаралоги белков рибосом nZUR pZUR AdcR

38. (в скобках – мотив «цинковая лента») nZUR pZUR AdcR

39. Сводка наблюдений: • Makarova-Ponomarev-Koonin, 2001: • L36, L33, L31, S14 – это единственные рибосомные белки, дуплицированные более, чем в одном геноме • L36, L33, L31, S14 – четыре из семи рибосомных белков, содержащих мотив цинковой ленты (четыре цистеина) • Из двух(или более)копий L36, L33, L31, S1, обычно одна содержит мотив цинковой ленты, а другая – нет • Среди генов, кодирующих паралоги рибосомных белков, как правило одни регулируется цинковым репрессором, а соответствующий белок никогда не имеет мотива цинковой ленты

40. недостаточно цинка: весь цинк потреблен рибосомами, ферменты голодают Плохой сценарий достаточно цинка

41. недостаточно цинка: часть рибосом включает белки, не содержащие цинка – остается для ферментов Хороший сценарий достаточно цинка

42. Регуляторный механизм Sufficient Zn ribosomes R repressor Zn-dependentenzymes Zn starvation R

43. Предсказание …(Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Aug 19;100(17):9912-7.) … и подтверждение(Mol Microbiol. 2004 Apr;52(1):273-83.)

44. Перспективы • Другие типы данных • Экспрессия генов на олигонуклеотидных чипах • Концентрации метаболитов • Протеомика: концентрации белков • Белок-белковые взаимодействия • Белок-ДНКовые взаимодействия • Автоматизация • Эукариоты • Моделирование метаболизма • Потоковые алгоритмы • Связь с результатами геномного анализа

45. А.А.Миронов А.Б.Рахманинова В.Ю.Макеев М.А.Ройтберг В.А.Любецкий Eugene Koonin Andrei Osterman Pavel Pevzner Nicole Hugovieux-Cotte-Pattat П.Новичков Д.Родионов А.Витрещак Е.Панина Э.Пермина О.Лайкова А.Казаков А.Герасимова Е.Котельникова Н.Садовская Д.Равчеев Г.Ковалёва