1 / 40

CAT

CAT. DNA-ANALYSE VIA FLOWCYTOMETRIE. APR. INGE THOELEN. U.Z. LEUVEN, 3 MEI 2005. WAT?. Analyse DNA-inhoud DNA-aneuploïdie: Diploïd: 46 chromosomen Hyperdiploïd: > 46 chromosomen Hypodiploïd: < 46 chromosomen Maligne cellen: numerische en structurele chromosomale aberranties

huey
Télécharger la présentation

CAT

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. CAT DNA-ANALYSE VIA FLOWCYTOMETRIE APR. INGE THOELEN U.Z. LEUVEN, 3 MEI 2005

  2. WAT? • Analyse DNA-inhoud • DNA-aneuploïdie: • Diploïd: 46 chromosomen • Hyperdiploïd: > 46 chromosomen • Hypodiploïd: < 46 chromosomen • Maligne cellen: numerische en structurele chromosomale aberranties • DNA-analyse: enkel numerische aberranties! • ≠ fasen celcyclus: G1, S, G2 → %S-fase fractie (tumor-proliferatie)

  3. HOE? • Staal: beenmerg, bloed, weefselbiopten • Isoleren en kleuren celkernen m.b.v. CycleTEST PLUS DNA reagens kit (BD): • Lyseren RBC (RCLB, zelfbereid) • Oplossing A: detergent, trypsine • Oplossing B: trypsine inhibitor, RNase • Oplossing C: propidium jodide (intercalator) • Vervolgens flowcytometrische analyse (FACSCalibur, BD) • Auto-analyse resulterende DNA-histogram met ModFit LT® software

  4. PRINCIPE FLOWCYTOMETRIE FACScalibur (BD) Sample Sheath fluid Argon Laser

  5. DNA FLOWCYTOMETRIE PI Fluorescentie detector 488 nm 620 nm Amplifier 1 256 Multichannel pulse height analyser

  6. DNA-HISTOGRAM

  7. DNA-HISTOGRAM De DNA-index (DI) is de ratio van de gemiddelde relatieve DNA-inhoud van de G1-cellen van de patiënt en de gemiddelde relatieve DNA-inhoud van de diploïde G1-referentiecellen. Cellen met een normaal diploïd karyotype hebben per definitie een DI=1.

  8. ANALYTISCHE PERFORMANTIE • # events > 10.000 • CV diploïde piek ≤ 3% • % B.A.D. (debris/aggregaten) < 20% • (Reduced Chi-Square (RCS): goodness of fit) • 1,0 tot 3,0: goed • 3,0 tot 5,0: matig • > 5,0: slecht Prout’s Neck DNA Cytometry Consensus Conference guidelines, USA 1992 (Shankey et al., 1993)

  9. WAAROM? • Ploïdie-status blasten is prognostische indicator in acute lymfoblastische leukemie (ALL) • DNA-index opgenomen in risico-classificatie criteria pediatrische ALL(< 18 jaar) • Behandeling verschillend naargelang risicogroep • Kinderen met zeer laag risico op recidief: minder intensieve en minder toxische therapieschema’s; zeer hoog risico-ALL: aangepaste en aggresievere therapie

  10. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE • Systemische, neoplastische proliferatie van lymfoblasten • +/- 70% van de gevallen: patiënten < 17 jaar • ALL meest voorkomende vorm van kanker bij kinderen: +/- kwart van de kankerdiagnoses • Acute leukemie bij kinderen: ALL/AML → 5:1 • Genezingskans pediatrische patiënten: 80% • Ongekende etiologie • Bestraling • Genetische factoren: Down syndroom

  11. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE • Klinisch: bloed cytopenieën (bleek, vermoeid, bloedingen, koorts, infecties), extramedullaire leukemische infiltraten (CNS, lymfadenopathie, hepatosplenomegalie) • Origine blasten: • Precursor B-lymfocyten: 85% • Precursor T-lymfocyten: 15% • Classificatie morfologisch (FAB): L1, L2, L3 (Burkitt) • Classificatie immunofenotypisch (EORTC): • Pro-B ALL, common B, pre-B, mature B • Pro-T ALL, pre-T, cortical T (common-T), mature T

  12. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE Uit “Immunofenotypering in de diagnostiek: Indicatiestellingen, uitvoering en interpretatie”, Hoofdstuk 8, Adriaansen J. et al., 1994.

  13. ACUTE LYMFOBLASTISCHE LEUKEMIE FAB L1, common B-ALL

  14. BEHANDELINGSSTRATEGIE • Grondige evaluatie van risico op recidief: voorkomen van over- of onderbehandeling • Meeste pediatrische hemato-oncologische centra: deelname aan klinische studies waardoor behandeling volgens gestandaardiseerde onderzoeksprotocols • Geen uniform risico-classificatiesysteem • Belangrijke risico-classificatie criteria: • Initieel WBC-aantal • Leeftijd bij diagnose • Cytogenetica en ploïdie • Immunofenotype • Respons op inductietherapie

  15. RISICO STRATIFICATIE

  16. EORTC PROTOCOL 58951 “Dexamethasone vs prednisolone during induction and maintenance therapy, prolonged vs conventional duration of L-Asparaginase therapy during consolidation and late intensification, in ALL and NHL of childhood. A Randomised phase III.” • EORTC: European Organisation for Research and Treatment of Cancer • CLCG (EORTC Children’s Leukemia Cooperative Study Group) trial 58951: België, Frankrijk, Portugal • Vier risicogroepen: • Very low risk (VLR) • Average risk 1 (AR1) • Average risk 2 (AR2) • Very high risk (VHR)

  17. VLR CRITERIA • ALL of B-cell lineage • WBC less than 10,000/mm3 • Must meet 1 of the following conditions: • DNA index greater than 1.16 and less than 1.50 and chromosome number 51-66 or unknown • DNA index not assessed and chromosome number 51-66 • DNA index greater than 1.16 and less than 1.50 and chromosome number is unknown • Good response to prephase therapy • Absence of t(9;22) or BCR/ABL, t(4;11)/MLL-AF4, or 11q23/MLL rearrangement • No acute undifferentiated leukemia (AUL) • No CNS or gonadal involvement • Precursor B-lymphoblastic NHL stage I or II

  18. AR CRITERIA • Must meet 1 of the following criteria: • ALL with good response to prephase therapy who are neither VLR or very high risk (VHR) • VLR ALL with CNS involvement (CSF positive or negative) • Precursor B-lymphoblastic NHL stage III or IV without any VHR feature • Precursor T-lymphoblastic NHL • AR patients substratified in: • AR1: B-cell lineage ALL with WBC less than 100,000/mm3 • Surreptitious or hemorrhagic CSF becoming negative at D4 of prephase therapy • Precursor B-lymphoblastic NHL stage III or IV • Precursor T-lymphoblastic NHL stage I or II • AR2: B-cell lineage ALL with WBC at least 100,000/mm3 • T-cell lineage ALL regardless of the WBC • Overt or non-equivocal CNS involvement at D0 or any CSF involvement at D4 • Gonadal involvement • Precursor T-lymphoblastic NHL stage III or IV • Newborn Down syndrome patients with AR2 features are assigned to the AR1 group

  19. VHR CRITERIA • Must meet 1 of the following criteria: • ALL patients meeting 1 of the following conditions: • Poor response to prephase therapy (at least 1,000/mm3 blasts in peripheral blood after completion of prephase therapy) • t(9;22) or BCR/ABL • t(4;11)/MLL-AF4 • 11q23/MLL rearrangement • Near haploidy (no more than 34 chromosomes or DNA index less than 0.7) • Hypodiploid (35-40 chromosomes or DNA index 0.7 to 0.8) • AUL • For B lineage ALL: failure to achieve complete response (CR) after completion of protocol IA • For T lineage ALL: failure to achieve CR or good partial response (GPR) after completion of protocol IA • Minimal-residual disease (greater than 1,000 blasts/100,000 mononuclear bone marrow cells) at evaluation of IA (day 35) • NHL patients who failed to achieve CR or GPR after completion of protocol IA • All VHR patients are eligible for stem cell transplantation except those whose sole VHR criterion is a poor response to prephase therapy and who have none of the following features: • T-cell immunophenotype • Early B ALL (CD10 negative) • WBC at least 100,000/mm3 • Newborn Down syndrome patients with VHR features are assigned to AR1 group

  20. PLOÏDIE DISTRIBUTIE UK, 1990-1997 UZ Leuven, 1998-2005 Harrison C.J., Blood Reviews, 2001.

  21. DNA-analyse onder de loep…. 1. Doen we het goed? 2. Gaan we de analyse behouden?

  22. AANVRAAGFREQUENTIE

  23. CYTOGENETICA • Cytogenetica: complementaire versus alternatieve methode • Karyotypering en FISH: numerische én structurele chromosomale abnormaliteiten • ALL: lage mitose-index, lage kwaliteit van de metafasen → karyotypering vaak bemoeilijkt • Doch slechts 1x geen diagnose via karyotypering op een totaal van 82 stalen (1.2%) door CME UZ Leuven • FISH tevens uitgevoerd indien geen definitieve conclusie via karyotype • Cytogenetische testen: langere antwoordtijden ( DNA-analyse: < 2 dagen) • Karyotypering: +/- 3 dagen • FISH: tot +/- 1 maand

  24. KARYOTYPERING Hyperdiploïd karyotype 56, XY Philadelphia chromosoom t(9;22)

  25. RETROSPECTIEVE ANALYSE: WAAROM? • Zeer lage uitvoerfrequentie: vervallen reagentia, matige expertise • Geen adequate interne controle (normaal perifeer bloed  PBMC) • Geen interne kwaliteitscontrole met kippen erytrocyt nucleï (DNA QC Particles, BD) • Geen kalibratie flowcytometer • Geen controle lineariteit • Geen controle resolutie

  26. RETROSPECTIEVE ANALYSE • Resultaten DNA-analyse vergelijken met de karyotypering • Slechts 82 stalen tussen januari 1998 – maart 2005 • DNA-analyse praktisch altijd op beenmerg uitgevoerd, slechts in 2 gevallen op perifeer bloed • Karyotypering: (vermoedelijk) altijd op beenmerg

  27. RESULTATEN • 68%: goede correlatie tussen DNA FCM en karyotypering • Gebrekkige correlatie in 21 gevallen (26%): altijd slechts 1-3 chromosomen afwijkend → te lage resolutie FCM • Look et al. (1985), Hiddemann et al. (1987), Perez-Vera et al. (2004) missen eveneens lage hyperdiploïdie/hoge hypodiploïdie met DNA FCM • Deze gebrekkige correlatie echter geen invloed op risico stratificatie (> 50 chromosomen: VLR, ≤ 40 chromosomen: VHR) • 5 (6%) belangrijke discordanties DNA FCM  karyotypering

  28. DISCORDANTIES • 3 gevallen met meerdere leukemische lijnen (patiënt 24, 48, 49) • Leukemische lijn met laagste ploïdie arbitrair als primaire lijn • Prognostisch minst gunstige lijn bepaalt het risico • Risico diploïdie  lage hyperdiploïdie  near tetraploïdie > risico hyperdiploïdie • 1 geval (patiënt 47) met correcte analyse (DI = 1,14), echter foutief gerapporteerd • 1 geval (patiënt 46) foutief geanalyseerd als diploïd (histogram toont schouder!)

  29. DNA FCM VS CYTOGENETICA • DNA-analyse na uitsluiten onoverkomelijke discordanties: 1 foutieve interpretatie op een totaal van 82 stalen (1,2%) • Karyotypering: 1x geen diagnose (1,2%), FISH toont wel vermoeden van hyperdiploïdie • Deze twee gevallen telkens toch toegewezen aan de very low risk-groep op basis van het cytogenetische respectievelijk het DNA-analyse resultaat

  30. LINEARITEIT

  31. LINEARITEIT Cut-off voor gunstige hyperdiploïdie: DI ≥ 1,16 of > 50 chromosomen!

  32. LINEARITEIT • Look et al. (Blood, 1985) • DI ≥ 1,16 geassocieerd met ≥ 53 chromosomen • Uitzonderingen: individuele chromosomen kunnen tot 4,5-voud variëren in DNA-inhoud • Cut-off van 1,16 dient met de grootste voorzichtig-heid gehanteerd te worden • Matige lineariteit van DNA FCM in ons laboratorium voornamelijk te wijten aan slechte lineariteit flowcytometer (immers geen controle!)

  33. DIAGNOSTISCHE PERFORMANTIE • DNA-index geen diagnostische maar prognostische waarde • Diagnose van very low risk-patiënten (DI ≥ 1,16 en > 50 chromosomen) • Vals negatief resultaat: DI < 1,16 en > 50 chromosomen → sensitiviteit = 17/24 = 71% • Vals positief resultaat: DI ≥ 1,16 en < 50 chromosomen → specificiteit = 54/54 = 100% • Rekening gehouden met de matige lineariteit van de flowcytometer → vals negatief resultaat in ons labo definiëren als DI ≤ 1 en > 50 chromosomen  sensitiviteit = 23/24 = 96% • Sensitiviteit/specificiteit DNA-analyse: moeilijk tot geen exacte cijfers terug te vinden in de literatuur • Enkele onderzoeksgroepen (Hiddemann et al., Perez-Vera et al.): sensitiviteit van 100% • Andere onderzoeksgroepen (Smets et al., Look et al.): near-100% retrieval van hyperdiploïdie d.m.v. DNA FCM

  34. KOSTEN IMPACT • Bij elke aanvraag analyse steeds op drie verschillende celsuspensies uitgevoerd • Cellen patiënt • Cellen patiënt + normale controle • Cellen normale controle • Totaalkost/test: 32,28 € • Honoraria RIZIV voor ambulante patiënt en enkelvoudig voorschrift (B450-test): 23,23 € • Nettokost/test: 9,05 € • Prijs CycleTEST PLUS DNA reagens kit (BD; 40 testen): 233 € • Prijs DNA QC Particles kit (BD; 25 controles): 294 €

  35. OVERGEBRUIK/ONDERGEBRUIK DNA-ANALYSE • UZ Leuven: enkel bij nieuwe diagnose pediatrische ALL • Andere mogelijke indicaties: • Multiple myeloma (hyperdiploïdie hier ook betere prognose) • Non-Hodgkin lymfomen (%S-fase fractie) • Vaste weefseltumoren (bijv. borsttumor: %S-fase fractie) • Andere ziekenhuizen: • UZ Gent: ALL, neuroblastoma (reagens kit Beckman Coulter) • AZ VUB: ALL (stalen worden doorgestuurd naar extern labo) • Virga Jesse Hasselt: multiple myeloma, lymfomen, weefseltumoren (reagens kit BD) • UZA: multiple myeloma (zelf-bereide reagentia) • DNA FCM en karyotypering gelijktijdig uitgevoerd om risico op vals negatieven te beperken, sequentiële strategieën echter meer kosten-efficiënt

  36. Gaan we de DNA-analyse behouden of afschaffen in ons laboratorium?

  37. Snelle antwoordtijd (meestal binnen 24 uur) Pediaters voor behoud: DNA FCM en karyotypering als wederzijdse controle → keuze therapieschema Sensitiviteit in ons labo slechts 71% bij cut-off DI ≥ 1,16 DI is géén vereiste voor risico stratificatie (ploïdie via karyotypering volstaat) Karyotypering en FISH superieur aan DNA FCM Analyse is verlieslatend Mogelijkheid van doorsturen naar extern labo (echter antwoordtijd  ) PRO CONTRA

  38. KWALITEIT VERBETEREN? • Aliquots maken van de reagentia en bewaren op -18°C • Adequate interne controle: PBMC i.p.v. vol bloed • QC-kit of overeenkomst met BD voor (half)jaarlijkse controle en kalibratie zoals voor de overige flowcytometrische testen • Eventueel zelf-bereide reagentia i.p.v. commerciële kit (goedkoper, langere houdbaarheid) • Verhogen uitvoerfrequentie (M. Kahler, lymfomen, weefseltumoren)?

  39. TO DO • Overleg met de pediaters: voor- en nadelen van de DNA-analyse goed tegen elkaar afwegen  test al dan niet afschaffen • Indien de test behouden blijft, stappen ondernemen om de kwaliteit te verbeteren (aliquots, PBMC, afspraken BD, …) • Pediaters informeren over de matige lineariteit tussen DI en # chromosomen: voorzichtigheid geboden bij hanteren van de cut-off van 1,16

  40. THE END…

More Related