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Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires

“Biomolécules ”. Journées Pédagogiques et Scientifiques Matrice Extracellulaire 7-8 septembre 2006 Faculté de Pharmacie, Marseille. Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires. Roselyne GARNOTEL

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Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires

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Presentation Transcript

  1. “Biomolécules” Journées Pédagogiques et Scientifiques Matrice Extracellulaire 7-8 septembre 2006 Faculté de Pharmacie, Marseille Modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire et cellules inflammatoires Roselyne GARNOTEL Laboratoire de Biochimie et Biologie Moléculaire, CNRS UMR 6198, UFR Médecine, IFR 53 Biomolécules, Reims

  2. INTRODUCTION

  3. Interactions collagènes/cellules sanguines polynucléaire neutrophile ou monocyte COMPARTIMENT INTRAVASCULAIRE 1. Recrutement cellules endothéliales 3. Diapédèse 2. Adhésion membrane basale ou collagène IV collagène I MATRICE EXTRACELLULAIRE ± MODIFIEE 5. Explosion respiratoire (DGGRYY sur a1CB6) Libération de MMPs 4. Contact collagène/cellules sanguines (RGD)

  4. Le collagène de type I télopeptide N-terminal télopeptide C-terminal zone hélicoïdale ( triple hélice ) DGGRYY RGD Demi-vie : 15 ans

  5. Les cellules inflammatoires Les polynucléaires neutrophiles : principales cellules de défense de l’organisme sont impliqués dans les réponses inflammatoires, la phagocytose bactérienne… Les monocytes : sont impliqués dans les réponses inflammatoires et la production de cytokines régulatrices sont transformés en macrophages tissulaires qui sont les cellules pivot de l’inflammation chronique sont en contact du collagène I, le composant majoritaire de l’espace sous-endothélial

  6. Les récepteurs de type intégrine Famille des intégrines Structure des intégrines b2

  7. O2- O2 p47 phox p67 phox p21 rac GTP NADPH P NADP+ + H+ p40 phox P P p21 rac GDP GDI GDI La NADPH oxydase MEMBRANE PLASMIQUE p22 phox gp91phox CYTOSOL p47phox p67phox p40 phox

  8. Les métalloprotéinases matricielles • - dégradent au moins un des composants de la matrice extracellulaire • - sont synthétisées sous forme latente appelée proMMP • - nécessitent une activation extracellulaire par clivage du prodomaine • - contiennent un site de liaison au zinc dans le domaine catalytique • - sont inhibées par les TIMPs (inhibiteurs spécifiques tissulaires) • sont divisées en familles dont une est celle des gélatinases • (A et B, ou MMP-2 et MMP-9 )

  9. domaine fibronectine type II domaine hémopexine Zn2+ Structure primaire des gélatinases peptide signal pro-peptide domaine catalytique région charnière Les métalloprotéinases matricielles

  10. PAIs a2-macroglobuline TIMPs TIMPs La cascade protéolytique t-PA u-PA plasminogène plasmine pro-collagénase (proMMP-1) pro-stromélysine (proMMP-3) Stomélysine (MMP3) collagénase (MMP1) pro-gélatinase B (proMMP-9) gélatinase B (MMP-9)

  11. Simple chaîne (sc-uPA) N C EGF Kringle protéinase u-PA de haute MM (55 kDa) S-S C N EGF Kringle protéinase Double chaîne (tc-uPA) S-S u-PA de faible MM (30 kDa) N C protéinase L’u-PA (urokinase type-Plasminogen Activator) - fait partie de la famille des Sérine protéinases. - contient un domaine analogue à l’EGF, un domaine « kringle » et un domaine catalytique. - se fixe à un récepteur membranaire (uPAR).

  12. Interactions entre le collagène de type I et cellules inflammatoires

  13. Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I

  14. Adhésion despolynucléaires au collagène de type I Activation des polynucléaires au contact du collagène I avec libération de radicaux libres oxygénés exocytose des granules Implication de l’intégrine LFA-1 ou aLb2 ou CD11a/CD18 Mise en évidence des voies de transduction impliquées CAS CAS pepsiné GARNOTEL, R, MONBOISSE, J.C., RANDOUX, A., HAYE, B., BOREL, J.P. The binding of type I collagen to LFA-1 integrin triggers the respiratory burst of human polymorphonuclear neutrophils. Role of calcium signalling and tyrosine phosphorylation of LFA-1. J. Biol. Chem., 1995, 270, 27495-27503.

  15. Interactions entre les monocytes et le collagène de type I

  16. MMP uPA cytokines Adhésion desmonocytes au collagène de type I Activation des monocytes au contact du collagène I avec libération de radicaux libres oxygénés Implication de l’intégrine gp150/95ou aXb2 GARNOTEL, R., RITTIE, L., POITEVIN, S., MONBOISSE, J.C., NGUYEN, P., MAQUART, F.X., RANDOUX, A., GILLERY, P. Human blood monocytes interact with type I collagen through axb2 integrin (CD11c-CD18, gp 150-95). J.Immunol., 2000, 164, 5928-5934. uPA Plasminogène -----> plasmine pro-MMP9 -----> MMP9

  17. Time (h) Pro-MMP9 MMP-9 Time (h) HMW uPA LMW uPA LMW uPA IL-6 TNF-a IL-1b Type I collagen Type I collagen Plastic Plastic 6 24 48 6 24 48 6 24 48 6 24 48 Libération de pro-MMP9 et d’uPA Activation de la pro-MMP9 en MMP9 Libération d’IL-6, IL-1b et TNF-a

  18. PD C NA CU Hetero-dimers Homo-dimers 1 h 2 h 3 h 1 2 3 Plast Coll Plast Coll Plast Coll PDTC 100 µM Curcumin 50 µM NAC 10 mM Control Pro-MMP9 HMW uPA LMW uPA Implication de NF-KB

  19. Les principales modifications post-traductionnelles de la matrice extracellulaire

  20. Modifications post-traductionnelles des proteines Fixation non enzymatique de métabolites simples Oses et dérivés : glycation Urée et dérivés : carbamylation Dérivés lipidiques ou de glycation : oxydation Remaniements moléculaires Altérations structurales et fonctionnelles des protéines Mécanismes de maturation / vieillissement impliqués en pathologie

  21. Athérosclérose Vieillissement physiologique Oxydation Glycation Oxydation Pathologies « post-traductionnelles » Diabète Glycation Oxydation Insuffisance rénale Carbamylation

  22. Glycation / glycoxydation non enzymatique Réaction chimique entre : groupement NH2 (a-NH2 terminal ou e-NH2-lysine d’une protéine ose simple (glucose) Réaction générale : In vitro : « brunissement des protéines » « réaction de Maillard », 1912 In vivo : diabète (1960), vieillissement physiologique et autres pathologies (1980) toutes les protéines Réaction spontanée, irréversible et cumulative (durée de vie)

  23. Oxydations, Clivages, Pontages Produits intermédiaires (aldéhydes réactifs) Produits avancés de la glycation («advanced glycation end products» ou «AGE» ou «Produits de Maillard») Pontages, Altérations….. Glycation / glycoxydation Base de Schiff Glucose + Protéine Produits d’Amadori Glycation + Oxydation = Glycoxydation

  24. La carbamylation est une modification post-traductionnelle non enzymatique des protéines, par fixation d’acide isocyanique provenant de la décomposition de l’urée O C -N O + NH2 NH4+ C NH2 Urée Cyanate O H R N R NH2 + C C HN O NH2 Protéine (Lysine -NH2) Acide Isocyanique Protéine carbamylée (Homocitrulline) Carbamylation

  25. Carbamylation des protéines Augmentation dans l'insuffisance rénale chronique (IRC) Perte de la fonction des protéines • Impliquée dans des réactions délétères • LDL carbamylées • (Athérosclérose au cours de l'IRC) • Collagène carbamylé • (Athérosclérose, inflammation et • infection au cours de l'IRC)

  26. Rôle central de la matrice extracellulaire en pathologie Les fonctions des cellules sont modulées par des stimuli provenant d’autres types cellulaires, mais aussi d’interactions spécifiques avec les protéines de la matrice extracellulaire (MEC). • Les protéines de la MEC sont particulièrement sujettes aux modifications post-traductionnelles, en raison de leur longue durée de vie. Les interactions cellules – matrice ne peuvent se concevoir sans prendre en compte ces modifications.

  27. Interactions entre le collagène de type I modifié et cellules inflammatoires

  28. La carbamylation du collagène de type I

  29. Taux de carbamylation du collagène I Hydrolyse acide (HCl 6 M – 18 h à 110°C) Analyse de la composition en acides aminés T2h C2h T6h C6h T24h C24h 1(I) - 2(I) - Lysine Homocitrulline Témoin 27 0 Carb 2h 25 2 Carb 6h 23 4 Carb 24h 16 11 Résultats exprimés en nombre de résidus pour 1000 Collagène de type I (tendons de queues de rat) incubé pendant 2, 6 et 24 heures à 37°C dans un tampon phosphate 0,15 M (pH 7,4) contenant 0,1 M KCNO Mobilité électrophorétique SDS-PAGE 5% Modifications de la composition en acides aminés et de la migration électrophorétique

  30. Carb 2h 10 µm 10 µm 10 µm 10 µm Carb 6h Carb 24h Témoin Modifications de l’aspect du réseau de fibres formé par le collagène carbamylé

  31. Electrophorèse Bidimensionnelle pHi : 3 10 Témoin 1(CB6) - Carb 6h 1(CB6) - Clivage du collagène témoin ou carbamylé 6 h par le bromure de cyanogène (CNBr) Analyse des peptides par SDS-PAGE 12,5 % (Mono- et Bidimensionnelle) Electrophorèse 1D Témoin Carb 6h 2(CB3-5) - 2(CB4) - 1(CB7-8) - 1(CB6) - 1(CB3) - Mise en évidence de la carbamylation du peptide a1CB6

  32. Interactions entre les polynucléaires et le collagène de type I carbamylé

  33. Chaque puits (32mm²) est recouvert par 25 µg de collagène témoin ou carbamylé Incubation des PNN pendant 2 heures à 37°C – Réduction intracellulaire du NBT (Abs 560 nm) Réduction du NBT (Abs 560 nm) Coll Témoin Coll Carb 2h Coll Carb 6h Coll Carb 24h Plastique Coll Témoin + fMLP 10-7 M Inhibition de l’activation des PNN par le collagène I carbamylé

  34. Carb 6h Carb 6h Témoin Pepsiné Témoin Pepsiné Incubation : 30 min Western Blot Anti-CD11a, CD11b et CD18 Incubation : 1h Réduction du NBT SDS-PAGE 12,5% ADHESION ACTIVATION Carb 6h MM Témoin Pepsiné 1(CB6) Coloration au Bleu Coomasie R250 La carbamylation du peptide a1CB6 entraîne l’inhibition de l’activation des polynucléaires

  35. Mesure de l’adhésion des PNN au collagène carbamylé en présence d’anticorps anti-LFA-1 (coloration au violet cristal) *: p<0,05 ; ** : p<0,01 Interaction des polynucléaires avec le collagène carbamylé via LFA-1 (CD11a/CD18)

  36. Temps d’incubation (min) : 0 2 2 2 - - Témoin Carb 24h p125FAK P [Y397] p125FAK Etude de la phosphorylation de p125FAK suite à un contact entre PNN et collagène carbamylé par Western Blot Inhibition de la phosphorylation de p125FAK suite au contact des polynucléaires avec le collagène carbamylé

  37. 2 µm 2 µm CAS CAS carbamylé JAISSON, S., LORIMIER, S., RICARD-BLUM, S., SOCKALINGUM, G.D., DELEVALLEE-FORTE, C., KEGELAER, G., MANFAIT, M., GARNOTEL, R., GILLERY, P. Impact of carbamylation on type I collagen conformational structure and its ability to activate human Polymorphonuclear neutrophils. Chem. Biol., 2006, 13, 149-159.

  38. Interactions entre les monocytes et le collagène de type I carbamylé

  39. Carbamylation du collagène et monocytes Carbamylation du collagène modifie les fonctions biologiques des cellules inflammatoires GARNOTEL, R., SABBAH, N., JAISSON, S., GILLERY, P. Enhanced activation of and increased production of matrix metaloproteinase-9 by human blood monocytes upon adhering to carbamylated collagen. FEBS Letters, 2004, 563, 13-16.

  40. CONCLUSION

  41. Quelle(s) modification(s) ? Quel(s) site(s) ? Protéine +/- Quel(s) traitement(s) ? Quel(s) mécanisme(s) ? Cellules +/- Quelle(s) fonction(s) ?

  42. Laboratoire de Biochimie Médicale et Biologie Moléculaire - CNRS UMR 6198 – Matrice Extracellulaire et Régulations Cellulaires - Reims Pr. Ph. GILLERY – Pr. F.X. MAQUART – Dr. S. JAISSON – Dr. C. DELEVALLEE-FORTE – Dr. N. SABBAH Dr. F. TOURE – Dr. A. SZCZYHEL Centre d’étude des Biomatériaux et Interfaces – INSERM ERM 0203 - Reims Dr. S. LORIMIER IBCP - CNRS UMR 5086 - Lyon Pr. Sylvie Ricard-Blum Unité Médian - CNRS UMR 6142 - Reims Pr. Michel Manfait - Dr. Ganesh Sockalingum - Dr. Grégory Kegelaer

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