1 / 71

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADES A ESTUDIS EPIDEMIOLÒGICS

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADES A ESTUDIS EPIDEMIOLÒGICS. VIRUS DE L’HEPATITIS C ( VHC ). http://www.census.gov/cgi-bin/ipc/idbagg. Population 2003. Prevalence of HCV (%)*. Infected population 2003. OCEANIA. 31919758. 1.88. 600091.4504.

ignatius-mendoza
Télécharger la présentation

TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADES A ESTUDIS EPIDEMIOLÒGICS

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. TÈCNIQUES DE BIOLOGIA MOLECULAR APLICADES A ESTUDIS EPIDEMIOLÒGICS

  2. VIRUS DE L’HEPATITIS C (VHC)

  3. http://www.census.gov/cgi-bin/ipc/idbagg Population 2003 Prevalence of HCV (%)* Infected population 2003 OCEANIA 31919758 1.88 600091.4504 Table 25-1. Estimated prevalence and number infected according to world population (2003) AFRICA 857087413 5.17 44311419.25 ASIA 3816573388 3.55 135488355.3 AMERICA 867610839 1.93 16744889.19 EUROPE 728996759 1.75 12757443.28 Total (2003) 6302188157 2.856 209902198.5 Quer J, Esteban JI Capt 25 Epidemiology HCV 3rd edition Viral Hepatitis Ed..H.Thomas, A. Zuckermann and S. Lemon. Pp407-425

  4. Fig. 25-3 HCV prevalence (%) General Population cohorts Sweden 0.3 Iceland 0.2 Russia 1.3-5.3 Canada 1.2 England & Wales1.07 Germany 0.4 France 0.3-1.73 Hungary 2.7 Uzbekistan 6.5 Asturias 1.2 Catalunya 1.0-2.64 Korea 1.4 USA 0.1-1.8 Italy 0.48-14.4 Turkey 0.1 Portugal 0.46 Greece 1.95-2.3 Japan 0.98-2 China 2.1 Israel 0.44 Japan (Shizuoka) 5.1-49 Jordan 0.65 Spain 1.0-2.64 San Diego 2.5 Tunisia 0.4 Libya 7.9 Egypt 8.7- 51 Saudi Arabia 0.9-5.3 India 0.0012-5.5 Taiwan 0.13-17 Mexico 0.7 Southern Taiwan 17 Pakistan 6.5 Hong Kong 0.5 Chad 4.8 Niger 1.8 Mauritania 1.1 Eritrea 1.9 Burkina Faso 4.9 Vietnam Hanoi 4 Jamaica <0.01 Senegal 2.2 Sudan 2.8 Thailand 2.0 Yemen 2.1-2.58 Philippines 1.6 Gambia 2.4 Nigeria 2.1 Nicaragua <0.01 Ehiopia 1.9 Guinea 5.5 Vietnam Ho Chi Minh 9 CAR 2.4 Somàlia 1.5 Venezuela <0.01 Cote d’Ivoire 3.3 Uganda 6.6 DR Congo 4.3-6.4 Benin 1.6 Togo 3.9 Ghana 1.7 Kenya 0.9 Rwanda 4.1 Cameroon 1.9-13.8 Kiribati 4.8 Burundi 11.3 Gabon 9.2 Equatorial Guinea 1.7 Vanautu <1 Brazil 3.0 Tanzania 3.2 Peru <0.01 >10% Papua New Guinea 1-12 Malawi 0.7 Zambia 0.2 Mozambique 2.8 Zimbabwe 2.0 Madagascar 2.1 5%-10% Australia 0.4-1.1 Swaziland 1.5 South Africa 0.1 2,5%-5% 1%-2,5% New Zealand 0.49 < 1% Quer J, Esteban JI Epidemiology. Capt 25 pp 407-425. In: Viral Hepatitis 3rd edition. Ed. H.C.Thomas, S.Lemon & A.J.Zuckerman. Blackwell Publishing. Oxford 2005.

  5. MECANISMES DE TRANSMISSIÓ DEL VHC • PARENTERAL: • Percutània: • Nosocomial • IVDU • Transfusió • Receptors de derivats sanguinis (factors coagulació -hemofíl·lics-, concentrats de plaquetes, IVIG) • Hemodiálisis • Trasplantaments d’òrgans • B. APARENMENT NO-PARENTERAL: • Tatuatges • Acupuntura • Treballadors sanitaris • C. NO PARENTERAL: • Vertical • Sexual, convivència • Drogaaddictes no IV.

  6. DADES HCV • INFECTATS A CATALUNYA (1-2.64%): • 70000 –185000 • TRASPLANTATS DE FETGE: • > 51% degut a infecció crònica per HCV (100% es reinfecten i el 35% pateixen cirrosis als 5 anys) • HEPATOCARCINOMA: • Incidència 7.5casos /100000hab. dels quals el • 65-75% infectats per HCV • Pacients amb cirrosis: 2.5% HCC per any

  7. RESPOSTA AL TRACTAMENT IFN + Ribavirina noG1 G1 34% 22% SVR SVR noSVR noSVR 66% 78% PROMIG RESPONEDORS AL TRACTAMENT: 50% CATALUNYA: 70000 INFECTATS amb 50% RESPOSTA  35000 persones que requeriran trasplantament en els propers anys

  8. RNA RNA RNA polimerasa MANCA DE MECANISMES DE CORRECCIÓ D’ERRORS Taxes de mutació(mutacions / nucleòtid / cicle de replicació) 10-3 - 10-5 F.Penin et al Hepatol 2004;39:5-19 VIRUS (104 nts i taxa mut. de 10-4) = 1 mutació/genoma

  9. Espectre de mutants Sequència master Sequència consens Els virus de RNA tenen una estructura en QUASISPÈCIES

  10. RBV resistant mutant Wild type C C C P2 P2 P3 P3 P2 P3 C C C P2 P2 P2 P3 P3 P3 G64S G64S G64S Isolation tissues IV inoculation Isolation tissues IV inoculation Isolation brain IV inoculation + RT-PCR Sac digestion Quasispecies diversity, pathogenesis and cooperative interactions Vignuzzi M, et al. Nature 2005

  11. Quasispècies Barreja de mutants relacionats entre sí, que estan replicant i sotmesos a procesos de mutació, competició i selecció natural.

  12. Estudis d’epidemiologia molecular: Objectiu: Quan es detecta una hepatitis provocada per virus (HCV o HBV), determinar quan i com es va produir la infecció per evitar que torni a ocórrer.

  13. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR) 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

  14. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR) 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

  15. A1- DEMOSTRAR INFECCIÓ: VHC? Genotip?

  16. Mètodes Serològics Mètodes Virològics Detecta Anticossos RNA Sensibilitat >95% >98% Especificitat Variable >98% Detecció post-exposició 2-6 mesos 2-6 setmanes Us Screening. Diagnòstic Diagnòstic, monitorització evolución infecció aguda i tractament antiviral DETECCIÓ DEL VIRUS DE L’HEPATITIS C Chevaliez S, et al. Int J Med Sci 2006; 3:35-40 Forns X, et al. J Hepatol 2006; 44:S35-S39 Ferreira-Gonzalez A, et al. Semin Liver Dis 2004; 24 (suppl 2):9-18

  17. ALT EIA-3 800 EIA-2 700 HCV RNA 600 500 400 300 200 ALT 100 EIA-1 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 8 10 12 2 4 6 8 weeks months years liver HCV RNA E2 100% c22 95-100% c33 95-100% NS5 40-80% c100-3 30-90%

  18. TÈCNIQUES DETECCIÓ RNA VHC TMA (transcription-mediated Amplification) b-DNA (branched-DNA) Primers, buffers, enzims Primers, buffers, enzims Sondes i ADN ramificat Múltiples còpies ARN cadena simple Múltiples còpies ADN doble cadena 1 sonda detecció x còpia amplificada 1 sonda detecció x còpia amplificada Múltiples sondes marcades x diana PCR (polymerase chain reaction)

  19. TÈCNIQUES DETECCIÓ IQUANTIFICACIÓ ARN VHC • QUALITATIVES • Basades en PCR o TMA • Més sensibles que majoria tècniques quantitatives (10-50 UI/mL) • Excel·lent especificitat i reproducibilitat • Essencials pel diagnòstic i monitorització tardana de la resposta al tractament • QUANTITATIVES • Basades en amplificació de diana (RT-PCR competitiva i RT-PCR en temps real) o amplificació de senyal (DNA ramificat) • Menor sensibilitat (excepte PCR en temps real) • Menor reproducibilitat (CV entre laboratoris 10-80%) • Diferències mètode extracció • Deficient estandardització genotip no1 • Molt sensible a variacions qualitat de la mostra • Pobre correlació entre diferents tècniques (especialment genotip no1) Pawlotsky JM. Gastroenterology 2002; 122:1554-68 Morishima C, et al. J Clin Microbiol 2004; 42:421-5 Ferreira A, et al. Semin Liver Dis 2004; 24:9-18 Caliendo AM, et al. J Clin Microbiol 2006; 44:1726-32 Halfon P, et al. J Hepatol 1996; 25:307-11 Sarrazin C, et al. J Clin Microbiol 2006; 44:729-37

  20. Tests DNA HBV

  21. RANG DINÀMIC TÈCNIQUES COMERCIALS QUANTITATIVES ARN VHC (UI/mL) 105 106 107 108 10 102 103 104 Cobas Amplicor HCV Monitor v2.0 (Roche) Versant HCV RNA 3.0 (Bayer) LCx HCV RNA assay (Abbott) Cobas Taqman HCV Test (Roche) Abbott real time HCV Test (Abbott) Rango carga viral 95 % Hepatitis C no tratada

  22. AUTOMATITZACIÓ EXTRACCIÓ RNA- AMPLIFICACIÓ TEMPS REAL COBAS AMPLIPREP AUTOMATED EXTRACTION PLATFORM COBAS TAQMAN (real time PCR)

  23. A1- DEMOSTRAR INFECCIÓ: VHC? Genotip?

  24. Genotips/Subtipus Confirmats HCV Genotipo Locus/Aïllat(s) Nombre (s) d’Accés Genotipo 1 1a HPCPLYPRE, HPCCGAA M62321, M67463 1b HPCJCG, HPCHUMR D90208, M58335 1c HPCCGS, AY051292 D14853, AY051292 Genotipo 2 2a HPCPOLP, JFH-1 D00944, AB047639 2b HPCJ8G, JPUT971017 D10988, AB030907 2c BEBE1 D50409 2k VAT96 AB031663 Genotipo 3 3a HPCEGS, HPCK3A D17763, D28917 3b HPCFG D49374 3k HPCJK049E1 D63821 Genotipo 4 4a HCV4APOLY Y11604 Genotipo 5 5a EUH1480, SA13‡ Y13184, AF064490 Genotipo 6 6a HCV12083, 6a33 Y12083, AY858526 6b Th580 D84262 6d VN235 D84263 6g HPCJK046E2 D63822 6h VN004 D84265 6k VN405 D84264 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

  25. DETERMINACIÓ GENOTIP VHC • Mètodes comercials serològics • EIA competitiu detecció anticossos epítops no estructurals genotip-específics (Murex HCV genotyping 1-6, Abbott) • Detecció genotip 90% inmunocompetents • Reactivitat creuada, falsos positius • Mètodes comercials moleculars • Seqüenciació directa 5’NC o NS5B (Truegene, Bayer) • Hibridació inversa 5’NC sondes tipus-específiques (InnoLipa HCV II, Innogenetics; Versant HCV genotyping assay, Bayer) • Detecció correcta 6 genotips >95% casos • Error subtipat 10-25% casos Pawlotsky JM. Semin Liver Dis 2003; 23:3-11 Simmonds P, et al. Hepatology 2005; 42:962-73

  26. G1 34% SVR noSVR 66% noG1 22% SVR noSVR 78% GENOTIPS i RESPOSTA a IFN  2a+Ribavirina 800mg/day 34% 66% 78% 22% Mangia A, et al. N Engl J Med 2005; 352:2609-17 Von Wagner M, et al. Gastroenterology 2005; 129:522 Zeuzem S, et al. J Hepatol 2006; 44:97-103

  27. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR) 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

  28. A2- BUSCAR POSSIBLE FONT D’INFECCIÓ. • 1.-Entrevista exhaustiva: • Possibles factors de risc descrits. • Possibles factors de risc no descrits però que involucrin risc de contacte amb productes infectats. • 2.-Pacients amb VHC que hagin coincidit amb el pacient infectat. • 3.-Obtenció de mostres de sèrum dels pacients possible font d’infecció

  29. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR) 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

  30. 1.-RECULLIDA i CONSERVACIÓ de la MOSTRA • L’HCV és un virus de RNA. El RNA es degrada fàcilment, sobretot per acció de les RNases. Una font de RNases molt important son les mans del manipulador, per la qual cosa, a més de treballar en un ambient lliure de RNases (material esterilitzat 4h a 180ºC, ...) cal treballar sempre amb guants. • SÈRUM o PLASMA: • Recollida en Vacutainer sense additiu (sèrum) o amb CitratNa (plasma) evitant EDTA i heparina (segons el tipus d’extracció de RNA) doncs son inhibidors de la PCR • Centrifugació i separació sèrum/plasma < 3 hores • Congelació - 40º C (- 70º C emmagatzament perllongat) • Evitar cicles de congelació-descongelació • BIÒPSIA de FETGE (fresca): • Guardar la mostra de teixit en un reactiu estabilitzador: RNAlater (Ambion #7020, Qiagen #76104). - 1 dia a 37ºC • - 1 setmana a 18-25ºC (Tª ambient) • - 1 mes a 2-8ºC • - Indefinit a –80º si després de 24h en RNAlater, es passa el teixit a criotub sense reactiu. • BIÒPSIA (congelada directament en nitrogen líquid o a –80ºC): • Abans d’extracció, incubar la mostra en RNAlater ice 16h a –20ºC. • BIÒPSIA en parafina: • Tamany promig de RNA viral obtingut: 650nts

  31. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR) 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

  32. 2.- EXTRACCIÓ d’ÀCIDS NUCLEICS RNA / DNA 1.- Extracció amb Tiocianat de guanidini i Fenol/cloroform (Chomczynski 1987). 2.- Columnes amb membranes de gel de silici: QIAGEN (Izasa), Ambion: 2a.- En cas de teixits cal passar per un pas previ d’homogeneïtzació 2b.- Kits per extracció de DNA i/o RNA total, mRNA, RNA viral, etc.... 3.- Automatització

  33. 2a.HOMOGENEÏTZACIÓ de TEIXITS, LLEVATS, BACTERIS... • 1.-Homogeneïtzador (potter) • 2.- Manual (vidres esmerilats...) • 3.- Automàtic: • Fastprepwww.qbiogene.com(Pacisa-Giralt) • MagNA lyser www.roche-applied-science.com

  34. 2a.HOMOGENEÏTZACIÓ AUTOMÀTICA de TEIXITS • 3.- Automàtic: • Fastprepwww.qbiogene.com(Pacisa-Giralt) • Consisteixen en una centrífuga que duu un rotor que a més de girar oscil·la de manera que agita el contingut del tub (up & down). • Els tubs estèrils on s’afegeix la mostra a homogeneïtzar contenen boles de ceràmica o de vidre. Es pot dur a terme en fred per evitar degradació dels àcids nucleics o proteïnes o be usar el primer buffer dels kits d’extracció de RNAtotal (RLT), RNAviral (AVL) o DNA (ATL). • Temps: 30-40”

  35. 2b. EXTRACCIÓ RNA. Columnes de gel de silici. www.qiagen.com www.ambion.com

  36. EXTRACCIÓ RNA-HCV • Plasma, sèrum o líquids: Qiamp RNA viral(50952904 / 06 Qiagen- Izasa) • Biòpsia de (fetge) conservat en RNAlater: • Homogeneïtzar amb Fastprep (Qbiogene-Pacisa Giralt) boles Lysing matrix D (tap color verd) 6913-050 • Extracció amb RNeasy mini kit(50974104)duu Tiocianat de Guanidini que ajuda a trencar cèl·lules • Limfòcits: RNeasy mini kit(50974104) • Biòpsia en parafina: • Tallar el bloc en 2-4 fragments de 5-10micres i desparafinar amb Xilè. • Extracció amb el kit: Recover all RNA(cat.1975 Ambion)

  37. Recomanacions. EXTRACCIÓ DNA-HBV Plasma, sèrum, sang, etc...: Qiamp DNA mini kit (50951304 Qiagen- Izasa) Biòpsia de (fetge) conservat en RNAlater:Biòpsia s'homogeneïtza amb Lysing matrix A (DNA) o D (RNA). Extracció amb Qiamp DNA mini kit. Biòpsia en parafina: Desparafinar amb Xilè i extreure amb Qiamp DNA mini kit

  38. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per doble PCR (RT-Nested-PCR). REGIÓ VIRAL A ANALITZAR 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

  39. RT-PCR 1.- Fase de còpia de RNA a cDNA. Transcripció reversa RNA + Hibridació “primer” 3’ (down) Síntesi de la primera cadena (cDNA) amb MMuLV-RT (42º 45min) RNA + cDNA cadena -

  40. RT- PCR 1.- Fase de còpia de RNA a cDNA. Transcripció reversa 2.- Fase d’amplificació del DNA. PCR Desnaturalització 95ºC Hibridació “primer” 5’ (up) 50º-55ºC Polimerització 72ºC. Taq DNA polimerasa Final cicle 1 = 2 molècules de DNA

  41. Desnaturalització 95ºC Hibridació “primer” 5’ (up) 50º-55ºC Polimerització 72ºC. Taq polimerasa Final cicle 2 = 4 molècules de DNA Final cicle 3 = 8 molècules de DNA Final cicle 4 = 16 AMPLIFICACIÓ EXPONENCIAL. 35 cicles

  42. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR) 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

  43. ABI PRISMTM 310 Sistema de Análisis Genético por Electroforesis Capilar

  44. Sequenciació Productes de PCR Valoració de la qualitat (gel d’agarosa) Quantificació (nanodrop) Seqüenciació Cíclica Eliminar primers & dNTPs de la reacció PCR. Nucleospin Extract II (Macherey-Nagel-Cultek)

  45. Rhodamine FS Terminator N T G C G C T C A C T G C C C G C T T T C C A G T C G G G A A A C C T G T C G T G C C A G C T G C A T T A A T G A A T C G G C C A A C G C G C G G G G A G A G C G G T T T G C G T A T T G G G C G C T C T T C C G C T T C C T C G C T C A C T G A C 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 dRhod Terminator G C G T T G C G C T C A C T G C C C G C T T T C C A G T C G G G A A A C C T G T C G T G C C A G C T G C A T T A A T G A A T C G G C C A A C G C G C G G G G A G A G G C G G T T T G C G T A T T G G G C G C T C T T C C G C T T C C T C G C T C A C 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 BigDye Terminator A T T G C G T T G C G C T C A C T G C C C G C T T T C C A G T C G G G A A A C C T G T C G T G C C A G C T G C A T T A A T G A A T C G G C C A A C G C G C G G G G A G A G G C G G T T T G C G T A T T G G G C 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340

  46. REGIÓ DE L’HCV A ANALITZAR? U U C U U Py-II U C C U A U G III II Py-I cccccccccuccc 5' IV I AUG 4 A 2+ Zn metallo-proteinase 3'UTR TGA UUU...UUU UUUCU...UUCUU 1024/5 809/10 1657/8 1711/2 1972/3 2420/1 190/1 383/4 746/7 Cleavagesites (aa) C 2 3 E1 E2 4B 5A 5B p7 5'UTR 3'UTR STRUCTURAL ? NON STRUCTURAL Protein size (KDa) p21 gp35 gp70 p7 p23 p70-72 p8-10 p27 p56-58 p68-70 RNA bindingNucleocapsid CofactorSer/Prot RNA-dependentRNA polymerase ? Function Envelopeglycoproteins Ser Protease/Helicase NTP Replicasefunction

  47. 4 A PERCENTATGE D’HOMOLOGIA entre GENOTIPS a nivell de NUCLEÒTIDS (AMINOÀCIDS) al llarg del genoma de l’HCV. Homologia nts (aa) (Okamoto J.Virol 1992) 55-75 (51-79) 81-91 (95-99) 65-72 (70-78) 67-71 (66-77) 70-80 (80-92) 65-79 (72-87) 66-79 (69-84) 92-98 26-79 C E2 2 3 E1 4B 5A 5B p7 p7 5'UTR 3'UTR STRUCTURAL NON STRUCTURAL Estudi epitops Resposta Immune Genotipat Estudis epidemiologia molecular

  48. En el sèrum i en el fetge d’un pacient infectat, trobem una població de virus tots ells diferents (persistència viral, dificultat en obtenció de vacunes, ...). Nosaltres emprem la variació per demostrar que un pacient s’ha infectat a partir d’un altre. Estudis d’epidemiologia molecular.

  49. ESTUDIS D’EPIDEMIOLOGIA MOLECULAR A. Estudi epidemiològic: A1- Demostrar infecció (virus, genotip). A2- Buscar possible font d’infecció. B. Demostrar la font d’infecció 1- Obtenció mostra de sèrum tant del pacient infectat com de les possibles fonts d’infecció. 2.-Tècniques d’extracció d’àcids nucleics. 3.-Amplificació del RNA per RT i doble PCR (RT-Nested-PCR) 4.-Seqüenciació 5.-Estudi fil·logenètic

More Related