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Southern, Northern e Western Blot. FISMA – FEA Curso de Biotecnologia Profa Cristina. Eletroforese. Eletroforese. A eletroforese em gel é uma das principais ferramentas de trabalho em Biologia Molecular.
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Southern, Northern e Western Blot FISMA – FEA Curso de Biotecnologia Profa Cristina
Eletroforese • A eletroforese em gel é uma das principais ferramentas de trabalho em Biologia Molecular. • Em geral, DNA, RNA e proteínas podem ser separados segundo o seu tamanho numa matriz usando um campo elétrico aplicado. • Na eletroforese em gel de agarose, o DNA ou o RNA é separado fazendo a amostra migrar através de um gel de agarose ou de poliacrilamida. • As proteínas são normalmente separadas segundo o seu tamanho usando eletroforese em gel de acrilamida; também podem ser separadas segundo a sua carga eléctrica usando focagem isoeléctrica.
A técnica de Southern Blot • O Southern blot é uma técnica que permite obter informação sobre a massa molecular e a quantidade relativa de uma determinada sequência de DNA. • A técnica, desenvolvida por Edwin Southern, é uma combinação de eletroforese em gel do DNA (este é frequentemente fragmentado por enzimas de restrição antes de fazer o Southern), transferência deste para uma membrana e hibridização com uma sonda marcada (radioativa ou fluorescente). • Após a hibridização, a membrana é lavada para remover sonda não ligada a DNA e obtém-se uma imagem através de autoradiografia ou autofluorescência. A imagem obtida dá a(s) localização(ões) do DNA que liga a sonda, com a intensidade do sinal dando uma medida relativa da quantidade de DNA que hibridiza.
Northern blot • O Northern blot estuda o perfil de expressão de RNA mensageiro, onde, quando e quanto de determinado RNA mensageiro (correspondente à expressão de um determinado gene) está presente numa dada amostra. • É uma das formas mais simples de determinar em que altura certos genes estão a ser expressos em sistemas vivos. • Neste processo, o RNA é separado numa eletroforese em gel, transferido para uma membrana e detectado de forma similar ao DNA no Southern blot.
Western blot • O Western blot usa o mesmo princípio do Southern blot e do Northern blot mas é aplicado a proteínas. Estas são separadas usando eletroforese em gel de poliacrilamida, na presença do detergente dodecil sulfato de sódio (SDS).
