Polymerase Chain Reaction

Biovetenskap och teknik Ht-10 Annica Nordvall Bodell Annica.Nordvall@ki.se Polymerase Chain Reaction

Polymerase Chain Reaction • Kary Mullis f.1944 • Presenterade PCR i Science 1985 • Nobelpriset i kemi 1993

Vad är PCR? • Kopieringsmaskin för DNA? • Kan påvisa att ett prov innehåller en viss gen

Varför var PCR revolutionerande? • Kan kopiera EN SPECIFIK DNA-sekvens bland tusen andra gener • Snabb (jämfört med genkloning) • Känslig kan detektera DNA från enstaka celler • Robust kan detektera DNA från fossila prover

Repetition: syntes av ny sträng • Templat: ssDNA som fungerar som mall för den nya strängen • Primer: för att starta DNA-syntesen • Nukleotider(dNTP´s): utgör ”byggstenar” i DNA • DNA-polymeras: enzym som bildar fosfodiesterbindning mellan 5´P och 3´OH

Vad behöver man i röret? • Templat (prov med DNA) • Forward primer (startsekvens) • Reverse primer (startsekvens) • dNTP´s (byggstenar) • Taq DNA polymeras • Buffert, salter Primers Nukleotider DNA Salt Polymeras Buffer

Vad händer i röret? Tre steg: • Denaturering 95oC • Annealing av primers 55-70oC • Syntes av ny sträng 72oC Detta upprepas 20-30 ggr www.ib.usp.br/evolucao/QTL/pcr.GIF

Taq Taq Två primers behövs DNA templat 3’ 5’ Riktning på extension 5’ 3’ reverse Primer 5’ 5’ forward Primer Riktning på extension 5’ 3’ • Forward primer • Hybridiserar uppströms om genen • Reverse primer • Hybridiserar nedströms om genen • Syntes ”in mot genen”

Taq DNA polymeras • Värmestabilt • Optimalt vid 72 °C • Adderar nukleotider komplementära till templatsträngen • Dubbelsträngad DNA bildas • Syntes från 5´till 3´ http://www.bio.miami.edu/~cmallery/150/gene/taq.polymerase.jpg http://www.cinnagen.com/images/smar%20taq%20dna%20polymerase.jpg

Amplifiering av målsekvens! http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/pcr.html http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/animations.html

Resultat • Området mellan primrarna; målområdet, ”target” amplifieras exponentiellt • x2 x2 x2 x2 osv…. • Efter 30 cykler har man fått ca 1 x 109 kopior av målområdet

Detektion av PCR-produkt • Gelelektrofores • Separation av DNA • Färgning av DNA • Alt: Realtids- PCR

Vad betyder ett band i gelen • Det har bildats DNA-molekyler vid PCR-reaktionen. • Primrarna måste ha bundit till DNA i provet • Det finns sekvenser som är komplementära till primrarna • Slutsats: Vi har påvisat att vårt mål-DNA fanns i provet

Tillämpningar • Diagnos av bakt/virusinfektion • Rättskemiska analyser • Diagnos av ärftliga sjukdomar • Sekvensering • Kloning • Kvantifiering av genuttryck (RT-PCR) • Med mera!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!

Begränsningar? • Man måste känna till sekvensen på båda sidor om den DNA-sekvens man vill amplifiera • Kan ej amplifiera långa gener

Problem vid PCR • Ospecifika produkter • Kontamination • Inhibition

Optimering av PCR-reaktion • Val av primerpar • Annealingtemperaturen (beror på primers) • Mg2+-koncentration

Ospecifika produkter • Vad har hänt? • Hur kan det bildas flera produkter?

Primerlängd • 8-mer ger statistiskt 46000 möjliga sekvenser att hybridisera till i humana genomet • 17-mer har 1 chans på 17179869184 bp att slumpmässigt hitta en komplementär sekvens Fig. 11.5 Brown Gene Cloning

Kontamination Positivt prov • ”Carry-over” kontamination från ett amplifierat positivt prov till ett nytt prov • En aerosoldroppe kan innehålla 500 kopior av målområdet • Efter amplifiering har man fått miljoner kopior; falskt positivt prov • För att upptäcka ev. kontaminering körs en negativ kontroll (utan templat DNA) Negativt prov kontamination

Separata rum • DNA extraktion • prePCR rum (renrum) • PCR rum

Inhibering • Rester från prov eller DNA-extraktion kan inhibera PCR-reaktionen • Risk för falskt negativa prov • Intern kontroll tillsätts, om den inte amplifieras tyder det på inhibering PCR-film

Brister med traditionell PCR • Separata steg för amplifiering och detektion; risk för kontaminering • Långsam, svår att automatisera • Mäter vid slutpunkt; osäker kvantif. • Svårt att jämföra effektivitet vid olika PCR-reaktioner

Realtids-PCR • Mha fluorescerande molekyler kan man detektera PCR-produkter varje cykel • Mätning av PCR-produkter under den exponentiella fasen ger ett säkrare värde än mätning efter att alla cykler körts (end point)

End point/Real time • Konventionell PCR • Analyserar produkten vid slutpunkt • Realtidsmätning • Bildad produkt detekteras med fluorimeter • Mäter PCR-produkt vid varje cykel http://www.lightcycler-online.com/ lc_principles/lc_principles_ind.htm

CT = Cykel vid tröskelvärde • Exponentiell fas. Varje cykel: 2x DNA Vid ett visst antal cykler har signalen nått över bakgrunden • CT=den cykel när signalen passerar ”tröskeln” • Ju mer mål-DNA desto lägre CT (BioRad)

Realtidsmätning ger säkrare kvantifiering 96 replikat av identisk reaktion Slutlig mängd varierar VARFÖR? Tröskelvärde (CT) varierar inte • (Fig från BioRad)

Realtids-PCR iCycler BioRad, mikrotiterplattor LightCycler Roche, kapillärer ABI Prism 7000 Applied Biosystem mikrotiterplattor

Realtids-PCR Fördelar • Lättare att undvika kontamination • Behöver ej öppna röret för detektion • Säkrare kvantifiering av mål-DNA

Realtids-PCR Tillämpningar • Kvantitativ analys (Q-PCR) • Ex. jmf mRNA i olika celler • Multiplex PCR (flera primerpar ger flera olika PCR-produkter) • Ex. detektera flera virustyper i samma prov • Detektion av mutationer (med FRETprober och smältkurvsanalys)

Spel • http://nobelprize.org/educational_games/chemistry/pcr/index.html

Länkar Gör en virtuell PCR: Gå in på nedanstående länk, http://www.biointeractive.org/vlabs/index.html Välj The Bacterial Identification Lab, Öppna dörren till labbet och kör en PCR!

Polymerase Chain Reaction