ZİNCİR SONLANMA YÖNTEMİ (DİZİ ANALİZİ)

1. ZİNCİR SONLANMA YÖNTEMİ(DİZİ ANALİZİ) Derya OKUYAN Mayıs.2010

2. DNA dizi analizleri (yada sekanslama) DNA birincil yapılarının tayininde ve nükleotid baz diziliminin belirlenmesinde kullanılan yöntemdir. • Analiz bir nükleik asit dizisinin diğerine hibridizasyonuna dayanır. Bu hibridizasyon sırasında radyoaktif yada radyoaktif olmayan maddelerle işaretleme yapılır.

3. delesyon, insersiyon vb. Dizi analizi; • Sıklıkla gen mutasyonları tespiti yada rekombinantDnaoluşum yapılarının tayininde kullanılır. • Ayrıca gen regülasyonunda yer alan genetik kontrol bölgeleri,konsensusdizileri, epistatikgenler ve etkileri belirlenebilmektedir. • Preimplantasyon tanısı, kalıtsal hastalık tayininde oldukça kullanılır.

4. Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebek embriyolarından alınan Dna’lar bu yöntemle analiz edilerek taşıyıcı embriyolar elenip genetik hastalık taşımayanların doğması sağlanmaktadır. • Yine aynı şekilde doku uygunluğu saptanmış embriyolardan sağlıklı doğacaklardan elde edilen kordon kanı ve kemik iliği hasta kardeşlerin tedavisinde kullanılmaktadır.

5. 1965 yılındaRobert HOLLEY tarafından 74 nükleotidlik bir tRNAmolekülünün dizi analizi yapılmıştır. • 1977 yılında Allan MAXAM- Walter GİLBERT ve Frederick SANGER tarafından iki farklı DNA dizi analizi yöntemi bulunmuştur. • 1982 yılında Akiyoshi WADA DNA dizi analizinin otomatik olarak yapılmasını önermiştir ve robotlar geliştirilmeye başlanmıştır.

6. 1986 yılında California Teknoloji Enstitüsünden (Caltech) Leroy HOOD ve Llyod SMİTH tarafından DNA dizi analizinde kullanılacak tam otomatik bir makine bulunmuştur. 1990 yılında Edward UBERBACHER tarafından bir gen bulma programı olan GRAİL kullanılmaya başlanmıştır. • 1999 yılında İngiltere, Japonya ve ABD’den bilim adamları tarafından insanın 22. kromozomunun DNA dizisi tamamlanmıştır.

7. Bu iki yöntemden, Sanger – Coulson’un yöntemi günümüzde daha yaygın olarak kullanılmaktadır. DİZİ analizinde 2 yöntem kullanılmaktadır a)Manuel(Radyoaktif işaretleme) b)otomatik(fluoresan işaretleme)

8. Allan MAXAM ve Walter GİLBERT ‘in geliştirdikleri yöntemin; • prensibi hidrazin, dimetil sülfat ya da formik asit ’in, DNA’ da bulunan bazları özgül olarak değiştirmesine ve daha sonra eklenen piperidinin değişikliğe uğramış nükleotitlerin bulunduğu noktalardan zinciri kırmasına dayanır… • nükleotit dizisi saptanacak olan DNA önce 5’- ucundan 32P ile ya da floresanbir boya ile işaretlenir. DNA’ nın iki iplikciği birbirinden ayrılarak ya da DNA uygun bir restriksiyon enzimi ile kesilerek DNA’ nın yalnızca bir ucundan işaretlenmesi sağlanır.

9. İkinci adımda; • ise DNA molekülleri dört tüpe ayrılarak A, C, G ya da T nükleotitlerini değiştirmek ve kırmak için gerekli tepkimeler gerçekleştirilir. • Reaksiyon için kısıtlı bir süre verilerek her tüpdefarklı pozisyonlardaki hedef nükleotidlerden kırılmış DNA parçaları elde edilir.

10. Sonuçta kırılmanın olduğu pozisyona göre hepsi 5’- pozisyonlarından işaretli ancak boyları birbirinden farklı bir dizi DNA fragmenti elde edilmiş olur. • Elde edilen boyları gittikçe kısalan DNA dizileri, jel elektroforezi ile birbirlerindenbüyüklüklerine göre ayrılır ve otoradyografiuygulanarak bantlar görüntülenir

11. Maxam ve Gilbert Yönteminde Kullanılan Kimyasallar

12. Pürinlerin kırılmasındadimetilsülfat kullanılır. • Dimetil sülfat ile N7 no’ lu pozisyonundan metillenen DNA’ ya bazik ortamda piperidinuygulanırsa DNA guanin bazından kırılır. Bazik ortam yerine asidik ortam tercih edilirse bu sefer DNA guaninyerine adenin bazından kırılır.

13. Pirimidinbazlarının kırılması ise hidrazin ile yapılır. • HidrazinDNA’ yıhem sitozin hem de timin bazından kırar. Bu iki reaksiyonu ayırmak için ise yüksek tuz derişimi (2M NaCl) ve bazik ortam kullanılır. Yüksek tuz derişimi ile bazik ortamda DNA sitozinbazından kırılır.

14. Dört farklı bazı ayırmada kullanılan reaksiyonlardan elde edilen parçacıklara elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülmeleri sağlanır. Uygulanan elektiriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere yol alırlar. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde saptanan parçacıklar kırılma pozisyonlarına göre okunurlar.

16. Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yöntemi • Bu yöntem enzimatik DNA sentezine dayanır ve günümüzün en yaygın kullanılan DNA dizi analizi tekniğidir. • Bu yöntemde dizisi saptanacak olan DNA ipliği yeni sentezlenecek iplik için kalıp olarak kullanılır. DNA sentezini sağlamak için Klenov, Taq DNA polimeraz, ters transkriptaz ya da sekuenazenzimlerindenbirisi kullanılabilir.

17. Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yöntemi • Yöntemin temeli DNA polimerazındNTP’lerin(deoksiribonükleozittrifosfat) yanısıradeoksiribozun3’ pozisyonunda OH grubu taşımayanddNTP’leride (dideoksiribonükleozittrifosfat) substrat olarak kullanabilmesine dayanır. Sentezlenen DNA’ya bir ddNTP’nin katılması 3’pozisyonunda OH grubu olmadığı için sentezi durdurur.

18. ddATP dATP

19. Dizi analiziyapılırken dört ayrı reaksiyon karışımı hazırlanır • Reaksiyonların her birinde çok az miktarda modifiyenükleotit kullanıldığı için yeni zincir sentezi rastgele sonlanarak bir dizi DNA fragmenti meydana gelir. kalıp DNA birprimer dNTP’ lerin dördü ddNTP’lerden biri

20. Reaksiyonlar sonucu elde edilen DNA parçalarına elektroforez uygulanarak jel üzerinde yan yana yürütülür. Uygulanan elektriksel alanın etkisi ile DNA parçacıkları en kısası en önde olmak üzere jel üzerinde bir merdiven görüntüsü oluşturur. İşaretleme yöntemine göre jel üzerinde, tespit edilen parçacıklar reaksiyon karışımına konulan ddNTP’ nin tipine göre okunur.

22. Sanger-Coulson Zincir Sonlanma Yönteminde Kullanılan Kimyasallar • Primerler: Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde istenilen DNA kalıbının çoğaltılması ve dizi analizinin yapılabilmesi için özgül oligonükleotitlereyani primerlereihtiyaç vardır. Primer çiftleri kullanılacak kalıp DNA’nıngenomik DNA’dan eldesinde, çoğaltılmasında kullanılır. Ayrıca primerler yöntemin son aşaması olan sonlanma reaksiyonunda polimerazenzimi için uygun 3’ucu sağlar. Her iki reaksiyondaki primer çifti aynı olabileceği gibi farklı primerlerde kullanılabilir.

23. Kalıp DNA • Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde hem çift, hem de tek zincirli DNA kullanılabilir. Yöntemin birinci aşamasında polimerazzincir reaksiyonu (PolymeraseChainReaction, PCR) tekniği ile elde edilen ve çoğaltılan DNA parçası kalıp DNA olarak adlandırılır. PCR ürünü kalıp DNA, önce reaksiyon artıklarından arındırılmalıdır. Bu çok özen gösterilmesi gereken bir aşamadır. Eğer kalıp DNA yeterince temizlenemezse bir sonraki sonlanma reaksiyonuna aktarılacak olan kimyasallar ile primer artıkları reaksiyonun hassasiyetini bozacaktır

24. Enzimler: • Sanger-Coulson zincir sonlanma yönteminde bir çok tipde DNA polimeraz enzimi kullanılabilmektedir. E.coli Klenow Fragmenti DNA Polimeraz I:İlk geliştirilen yöntemde kullanılan bu enzimin iki büyük dezavantajı vardır. Birincisi enzimin kontrolsüz olarak çoğaltma reaksiyonlarını yarıda kesmesidir. Özellikle uzun okumalarda bu problem iyice belirginleşmektedir. İkincisi enzimin homopolimerikbölgeler ile ikincil yapısı kuvvetli olan bölgelerde istenilen verimde çalışmamasıdır

25. Ters Transkriptaz: Ters transkriptaz (Reversetranscriptase) enziminin her ne kadar çok yaygın bir kullanım alanı olmasa da özellikle homopolimerik bölgelerde etkin çözüm verir. Enzim özellikle bu tip bölgelerde Klenowfragmentinden daha etkin ve kullanışlıdır. Sekuenaz Enzimleri:Sekuenaz(SequenasesTM) enzimleri T7 bakteriofajın’dan elde edilirler. Enzimin 3’-5’ ekzonükleaz aktivitesi inhibe edilmiştir. İnhibe edilen bu özelliği sayesinde enzim tek yönlü ve hızlı çalışır. Kalıp DNA’ nın uzun olduğu deneylerde yüksek özgül aktivitesi ve dayanıklılığı ile tercih edilir.

26. Taq DNA Polimeraz: • Özelilikle tek zincirli DNA dizisinin saptanmasında tercih edilir. Sıcaklığa dayanıklı olduğu için yaygın kullanılan enzim türüdür. Özellikle 95 0C’ da aktif olması nedeni ile homopolimerik bölgelerde bile çok etkindir.

27. Elektroforez: • DNA molekülleri fosfat grubu taşıdıkları için eksi (-) yüklüdür ve anoda doğru (+ kutba) hareket eder. Bu hareket DNA’ nın yapısına ve uzunluğuna bağlıdır. Jel boyunca kısa DNA fragmentleri daha hızlı yol alırken uzunluk arttıkça DNA’ nın hızı azalır. Her iki dizi analizi yöntemi ile elde edilen farklı uzunluklardaki fragmentlerin birbirlerinden ayrılması ve tanımlanmasında DNA’nın bu özelliği kullanılır.

28. Otomatik DNA Dizi Analizi • Otomatik dizi analizi için çoğaltılan PCR ürünleri çeşitli yöntemler kullanılarak temizlenir. En sık kullanılan temizleme yöntemi ticari kitlerin kullanıldığı silika temelli yöntemlerdir.

29. İşaretleme Reaksiyonu • Otomatik Dizi Analizi ticari olarak üretilen kitler kullanılır. En sık olarak ABI PrismBigDyeTMTerminatör Reaksiyon Kiti kullanılır. Bu PCR kitinin özelliği tüm PCR kimyasalları ile beraber, floresanboyalı ddNTP’lerileTaq DNA Polimerazenziminide tek bir karışım halinde bulundurmasıdır. “BigDyeReadyReactionMix”olarak adlandırılan bu karışıma sadece primervetemizlenmişkalıpDNAeklenir ve PCR başlatılır.

30. Amplifikasyon Koşulları 1 amplifikasyontüpü(20 μl) için reaksiyon karışımı: Kalıp DNA 8.0 μl BigDyeReadyReactionMix 8.0 μl Primer (3.2pmol / μl) 1.0 μl Distilesu 3.0 μl

31. PCR Programı • 96 0C‘ 10’’ • 50 0C‘ 5’’ 24 döngü • 60 0C‘ 4’’ • 40C’ 10’ 1 döngü

32. BigDyeTerminatör BAĞLANMA UZAMA ÜRÜNLER

33. Fluorescent Dyes Used in 4-Color DetectionFluorescent JOE (Green) TAMRA (Yellow) FAM (Blue) ROX (Red)

34. Örneklerin Hazırlanması • Örnek hazırlama sırasında amplifikasyon ürünü izopropanol çöktürmesi ile PCR artıklarından temizlenir. Bu aşama özellikle reaksiyona girmemiş floresan boyalı ddNTP’lerinuzaklaştırılmasıaçısındandaçok önemlidir. İşlem uygun şekilde yapılamazsa kontaminant boyalar lazer tarafından okunacak ve analizin hassasiyetini bozacaktır.

35. Örneğin Cihaza Yüklenmesi ve Elektroforezin Başlatılması • Örneklerizopropanol ile temizlenip alkol tamamen uzaklaştırıldıktan sonra işaretleme reaksiyonu ürünleri formamid veya TSR içinde çözülür. Örnekler denatüre edildikten sonra buz içinde şoklanarak cihaza yüklenir ve elektroforezbaşlatılır. Yürütme işlemi 15 kV gerilim ve 50oCsıcaklıkta gerçekleştirilir.

36. ABI Prism 310 Genetik Analizatörü • Kendinden önceki sistemlerden farklı olarak ABI Prism 310 Genetik Analizatörüpoliakrilamidjelmatriks sistemi yerine kapiler sistem içine doldurulan polimer jelmatrikssistemi içerir. • Cihaz iki ana parçadan oluşur. Birinci kısım veri ünitesidir. Veri ünitesi bir bilgisayarsisteminden ibarettir. Bu bilgisayarda, ikinci kısım ile bağlantıyı kuran ve ikinci kısmı kontrol eden programlar yüklüdür. İkinci kısım analizin yapıldığı elektroforezkısmıdır

38. Kontrol Sistemi • Tipik bir masa üstü bilgisayar sistemidir. Bu sistemde iki ana program yüklüdür. İki programdan birinin görevi elektroforez cihazı ile bağlantıyı kurmak, elektroforezkoşullarını sağlamak ve verileri toplamaktır. İkinci programın görevi ise toplanan verilerinin değerlendirilmesidir.

39. Elektroforez:

40. Non Radyoaktif İşaretleme İle DNA Dizi Analizi Radyoaktivitenin pahalı ve zararlı olması gibi dezavantajları olduğundannonradyoaktifyöntemler kullanılarak DNA dizi analizi yapılmaya başlanmıştır. Bu yöntemler: • Gümüş boyama tekniğiyle • Biotinlenmişprimer kullanılarak • Floresans işaretleme tekniğiyle • Magnetik parçacıklar kullanılarak • DNA bağlayan proteinlerle • Digoxigeninle DNA dizi analizi