Dunaújváros Megyei Jogú Város Polgármesteri Hivatala,

1. Angerer P. Ildikó, Bíró Borbála:Egyes gyomirtószerek és ipari szennyvíz talajmikrobiológiai hatásának értékelése Dunaújváros Megyei Jogú Város Polgármesteri Hivatala, Környezettudományi Doktori Iskola, Szent István Egyetem Gödöllő, MTA Talajtani és Agrokémiai Kutató Intézete E-mail:angerer@pmh.dunanet.hu VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

2. A kísérletek célja • Laboratóriumi in vitro kísérleti módszerek kifejlesztése a mikrobák stressz-tűrőképességének a mérésére • A stressz-tűrőképesség mikrobacsoportok, fajok és törzsek közötti variabilitásának vizsgálata • Az adaptáció mértéke és a környezeti működőképesség közötti összefüggések megértése, azaz a rövid- és a hosszabbtávú hatások értékelése • Tenyészedényes mikrokozmosz kísérletek az egyes mikrobacsoportok herbicid és szennyvíz-toleranciájának elemzésére rövidtávú és hosszabb hatás megfigyelése 3 hetes és 3 hónapos inkubáció során VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

3. Bevezetés In vitro kísérletsorozat: • A mikroorganizmusok klórszulfuron toleranciájának megállapítása céljából in vitro rázatásos, mikrofermentoros tenyésztést alkalmaztunk a gyomirtószer különböző koncentrációi mellet. • A mikroorganizmusok szaporodásának mértékét rázatás után fotometrikusan határoztuk meg a mikróba szuszpenzió extinkciójának mérésével. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

4. Bevezetés Tenyészedényes kísérletsorozat: 3 hétig, illetve 3 hónapig tartó laboratóriumi talajinkubációs modellkísérletben tanulmányoztuk a mezőgazdasági termesztés során alkalmazott gyomirtószer és ipari melléktermék hatását a talaj mikrobiális közösségeire. Ennek során „egy új generációs” herbicid, a 75 % klórszulfuron tartalmú Glean és egy kokszolói szennyvíz hatását elemeztük • az összcsíraszámra, • sugárgombákra, • szabadon élő N2-kötő baktériumokra • és néhány spóraképzőbaktériumfajra vonatkozóan VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

5. Mi is a Glean (klórszulfuron) ? A Glean (75 % aktív hatóanyaga a klórszulfuron) „új generációs” herbicid a szulfonilkarbamidok csoportjából, melyet a mezőgazdaságban a gabonafélék és a len gyommentesítésére használnak. 2-klór-//4-metoxi-6-metil-1,3,5-triazin-2-il/-aminokarbonil/-benzoszulfonamid VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

6. Anyag és módszer I./1. • A mikroorganizmusok klórszulfuron toleranciájának megállapítására in vitro rázatásos, mikrofermentoros tenyésztést alkalmaztunk. • A vizsgálandó tiszta törzseket szelektív ferde agarra leoltottuk, és 24 óráig inkubáltuk. Az elszaporodott törzseket steril fiziológiás sóoldattal lemostuk. • A megfelelő szelektív, folyékony táptalajokra (nutrient leves a baktériumok, AGS tápoldat a sugárgombák, és YMB a Rhizobium törzsek kitenyésztésére). • Sterilizálást követően a különféle mikroorganizmusok tiszta kultúráiból készült szuszpenziók kerültek leoltásra. • A továbbiakban a táptalajokhoz adagoltuk a klórszulfuron megfelelő dózisait (0,001, 0,01, 0,1, 1, 10 mg.kg-1). VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

7. Anyag és módszer I./2. • Az így kapott folyékony kultúrákat rázógépre helyeztük, és 24-48 órán át intenzív rázatás mellett 25oC-os hőmérsékleten inkubáltuk. Kontrollként azok a kultúrák szolgáltak, amelyeket herbicid bevitele nélkül tenyésztettünk ki. • A mikroorganizmusok szaporodásának mértékét fotometrikusan határoztuk meg. A mikroorganizmusok szaporodásának mértékét a kontroll kultúrával hasonlítottuk össze. A kísérletet három ismétlésben végeztük el. • Felhasznált mikroorganizmusok: Bacillus cereus var. mycoides, Bacillus subtilis, Rhizobium leguminosarum Bükköny 75/4, Rhizobium lupini Csf 75/1, Rhizobium meliloti LuK, Rhizobium trifolii Lóhere 73/3, Streptomyces griseus, Streptomyces liquor, Streptomyces sp. IX., Steptomyces sp. P.G., Streptomyces sp Sz5/a, Streptomyces sp. Sz5/b, Streptomyces sp. Sz5/c, Streptomyces sp. Sz5/d, Streptomyces sp Sz3/b. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

8. Anyag és módszer II./1. • A tenyészedényekbena Glean gyomirtószernek a szántóföldön ajánlott 10-20 g/ha dózis alapján megállapított 0,001 mg.kg-1 talaj-koncentráció mellett annak 10-szeres, 1000-szeres és 10000-szeres (0,01-; 1- és 10 mg.kg-1) koncentrációit is alkalmaztuk. • A szántóföldi vízkapacitás 60 %-os értékénél, 28 oC hőmérsékleten megvalósított, 3 heti, majd 3 havi inkubációnál egy kokszolói, ipari szennyvízzel való kombinációkat is kialakítottunk három ismétlésben. A kokszolói szennyvíz néhány kémiai tulajdonsága az alábbi táblázatban látható VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

9. Anyag és módszer II./2. • Az összes heterotróf csíraszám, a szabadon-élő nitrogén-kötők, a sugárgombák és a spóraképzők egy fajcsoportja, a Bacillus cereus var. mycoides kitenyésztésére szelektív Nutrient, Kongóvörös Ashby és Arginin-glicerin agar-lemezeket alkalmaztunk. • A mikrobaszámokat általunk módosított eljárással talajhígítási sorozatból állapítottuk meg és a telepképző egységek számát 1 g száraz talajra konvertáltuk. • Az átlagadatok log10-transzformált adatait ábrázoltuk, ahol a variancia-analízis eredményeként jelentkező szignifikáns (P0,5%) értékeket is jelöltük. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

10. Az in vitro kísérletek eredményei VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

11. Az in vitro kísérletek eredményei VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

12. Eredmények és értékelésükI./1. (in vitro) • A kísérlet során tesztelt mikroorganizmusok eltérően reagáltak a klórszulfuron különféle koncentrációira. Ez a különbség a gyomirtó szer eltérő koncentrációira, valamint a mikróbatörzsek egyéni érzékenységére vezethető vissza. • A klórszulfuronra a legérzékenyebb mikróbák a következők voltak: Rhizobium trifolii Lóhere 73/3, Rhizobium meliloti LuK. Ugyanakkor minden egyes herbicid koncentrációnálmegindult a mikroszervezetek szaporodása. • A Rhizobium leguminosarum Bükköny 75/4. szaporodását 0,001 és 0,01 mg.kg-1, a Bacillus cereus var. mycoides 0,01 mg.kg-1 herbicid koncentráció serkentette. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

13. Eredmények és értékelésükI./2. (in vitro) • Erős szaporodás serkentést figyelhettünk meg a Streptomyces griseus törzsnél, amelyről az irodalmi adatok tanulmányozása során kiderült, hogy képes lebontani a klórszulfuront. Ugyanakkor ezzel a módszerrel a Streptomyces griseus törzs szaporodása nehezen volt mérhető, mert a poliszacharid termelés miatt a sejtek flokkulálódtak, így 10 mg.kg-1 koncentrációnál az extinkciós érték nem volt meghatározható. • A Glean 75 DF serkentette a Streptomyces griseus, Streptomyces sp. IX., Streptomyces sp. Sz 5/a, Streptomyces sp. Sz 5/c, Bacillus mycoides szaporodását. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

14. Az mikrokozmosz kísérletek eredményei A kokszolói szennyvíz az összcsíraszám szignifikáns sejtszám-növekedését, míg a klórszulfuron sejtszám-csökkenést okozott a kontrollhoz képest. A kombinációk a szennyvizes kontrollhoz képest szignifikáns csökkenést mutattak. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

15. A mikrokozmosz kísérletek eredményei A szennyvíz közel egy nagyságrenddel megnövelte a sejtszámot a kontrollhoz képest. 0,01 mg.kg-1 klórszulfuron dózisnál és felette szignifikáns csökkenést észleltünk. A kombináció drasztikusan csökkentette a sejtszámot. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

16. A mikrokozmosz kísérletek eredményei Minden koncentráció és a herbicid-szennyvíz kombináció szignifikáns sejtszám-csökkenést okozott. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

17. A mikrokozmosz kísérletek eredményei A szennyvíz és a herbicid szántóföldi dózisa egymagában és kombinációban is szignifikánsan növelte a sejtszámot. A 10 mg.kg-1 dózis szignifikáns sejtszám-csökkenést okozott. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

18. A mikrokozmosz kísérletek eredményei A sejtszám a szennyvízkezelés hatására mind a klórszulfuronnal, mind pedig anélkül szignifikánsan lecsökkent. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

19. A mikrokozmosz kísérletek eredményei A herbicid 0,001 mg.kg-1 dózisa önmagában nem szignifikánsan, szennyvízzel való kombinációban viszont szignifikánsan serkentette a szaporodást. Magasabb koncentrációk drasztikus sejtszám-csökkenést okoztak kombinációban is. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

20. A mikrokozmosz kísérletek eredményei A herbicid szántóföldi, illetve 1000-szeres, 10000-szeres dózisai szignifikáns sejtszám-csökkenést eredményeztek, mely hatás a szennyvíz kombinációknál jelentősen enyhébbnek bizonyult. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

21. A mikrokozmosz kísérletek eredményei A herbicid szántóföldi és tízszeres dózisa szignifikáns növekedést, a 10000-szeres koncentráció ugyanakkor szignifikáns csökkenést okozott. A szennyvíz önmagában szignifikánsan csökkentette a csíraszámot, a herbiciddel csak az 1000-szeres és 10000-szeres koncentrációknál. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

22. Eredmények és értékelésük II./1. (mikrokozmosz) • Az egyes mikrobacsoportok eltérő toleranciát mutattak az alkalmazott herbicidre, a szennyvízre és a kettő kombinációjára. • Az anyagok közötti interakció az egyes komponensek külön-külön kimutatott hatását módosíthatja, ami a vizsgálati körülmények között a kokszolói szennyvíz toxikus cián, rodanid és fenol-tartalma miatt a kitenyészthető mikrobaszám további csökkenésében nyilvánult meg. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

23. Eredmények és értékelésük II./2. (mikrokozmosz) • A mikroorganizmusok közül a legnagyobb érzékenységet a szabadon élő nitrogénkötők mutatták, ami egybecseng a korábban megállapított környezeti stressz-tényezőkkel. • A sugárgombák és a kitenyésztett Bacillus faj csíraszámát ugyanakkor a herbicid 0,01 mg.kg-1 mennyiségei serkentették, amely hatás a sugárgombáknál az ipari szennyvízzel való kombinációkban is fennmaradt. • A mikrobacsoportok eltérő érzékenysége miatt a vizsgált talaj mikrobaközösségeinek az összetétele és esetleges aktivitása is módosult. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

24. Eredmények és értékelésük II./3. (mikrokozmosz) • A klórszulfuron hatóanyagú herbicid és az ipari szennyvíz kombinált alkalmazása tenyészedényes modellkísérletben a kitenyészthetőmikroba-csoportok közötti jelentős érzékenységi különbségekre mutatott rá. • A vizsgált környezeti abiotikus tényezővel szemben a nitrogénkötők (mikroszimbionták) nagyfokú érzékenysége bizonyosodott be. • A sugárgombák és a kitenyészthető Bacillus faj csíraszámában a herbicid kombinációknál serkentést is megfigyeltünk. (ANGERER et al. 2004.) VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

25. Összefoglalás, konklúzió I. • Rázatásos, mikrofermentoros in vitro kísérletek során megállapítást nyert, hogy a vizsgált mikroszervezetek közül a Rhizobium trifolii Lóhere 73/3 és a Rhizobium meliloti LuKjelű törzsekreagáltak legérzékenyebben a klórszulfuronra. • Erős szaporodás serkentést figyelhettünk meg a Streptomyces griseus törzsnél, amelyről az irodalmi adatokból kiderült, hogy képes lebontani a klórszulfuront. • A gyomirtószer stimulálta a Streptomyces griseus, Streptomyces sp. IX., Streptomyces sp. Sz 5/a, Streptomyces sp. Sz 5/c, Bacillus mycoides szaporodását. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

26. Összefoglalás, konklúzió II. Tenyészedényes modellkísérletek során megállapítottuk, hogy: • A mikrobiota összetételét a tápanyagokért folyó küzdelemben a környezeti természetes és mesterséges (vagy antropogén), biotikus és/vagy abiotikus tényezők különféle mértékben befolyásolják. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

27. Összefoglalás, konklúzió II. • A mikrobacsoportokra jellemző eltérő mértékű érzékenységi mintázatmódosítja a mikrobiális közösségek funkcionális csoportjainak számszerű arányait és a közöttük kialakuló együttműködési lehetőségeket is. • Ezeket az együttes környezeti hatásokat is célszerű figyelembe venni a xenobiotikumok és a mezőgazdasági, ill. Iparihulladékanyagok alkalmazásasorán. • A mikrobák stressztűrő képességének vizsgálatakor fontos kérdés, hogy egyes mikroszervezeteknél mennyi idő alatt alakul ki a peszticidekhez való adaptációjuk. Ennek megállapítására tartam-hatású kísérletek szükségesek. VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

28. Néhány fénykép a kísérletről VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

29. További tervezett kísérletek • További rövid- és tartamhatású kísérletek • Modellkísérletek növények felhasználásával • Szabadföldi kísérletek • Herbicid és szennyvíz-toleráns mikrobák izolálása VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.

30. KÖSZÖNÖM A FIGYELMET! Angerer P. Ildikó, Bíró Borbála Dunaújváros Megyei Jogú Város Polgármesteri Hivatala, Dunaújváros, Környezettudományi Doktori Iskola, Szent István Egyetem Gödöllő, MTA Talajtani és agrokémiai Kutató Intézete E-mail:angerer@pmh.dunanet.hu VII. Környezetvédelmi Konferencia, Dunaújváros, 2006. június 13.