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Lambda Zap

Lambda Zap. Cosmids. La sonde ‘a’ identifie les clones 1 et 2 Une sonde faite à partir de la séquence le plus 3’ du clone 2 va identifier les clones 3 et 4. Les sondes ( probes). Une sonde est une séquence d’ADN ou d’ARN qui peut hybrider avec une séquence complémentaire

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Presentation Transcript

  1. Lambda Zap

  2. Cosmids

  3. La sonde ‘a’ identifie les clones 1 et 2Une sonde faite à partir de la séquence le plus 3’ du clone 2 va identifier les clones 3 et 4

  4. Les sondes ( probes) • Une sonde est une séquence d’ADN ou d’ARN qui peut hybrider avec une séquence complémentaire • Cible: 5’ AATTCGTATCGATCGTAGATTTACAT 3’ • Sonde: 3’ TTAAGCATAGCTAGCATCTAAATGTA 5’ • Il faut que l’ADN cible et la sonde soit dénaturer-simple brin-pour que la sonde puisse se fixer ( donc traitement avec la soude ou chauffé à 95°C pour l’ADN) • Fabrication des sondes d’ADN: • -Random priming • -Transcriptase Inverse • -Kinase

  5. Les sondes et l’hybridation Sondes radioactives: p32: B radiation-nucléotide avec le phosphate radioactif sur le alpha, beta ou gamma phosphate.

  6. Hybridation des acides nucléiques • Le stringence: Les conditions d’hybridation et en particulier la concentration de sel et le température. • Augmente la concentration de selréduire la stringence • Augmente la températureaugmente la stringence • Sonde souris+banque souris-utilise une stringence forte car les séquences sont identiques • Sonde souris+banque mouche-stringence moins forte car les séquences ont divergé pendant évolution. • Conditions souvent employées: 0,8M NaCl/citrate, 65°C • Formamide: en présence de formamide on réduit la température d’hybridation37°C . Le temps d’une hybridation est variable: souvent la nuit Il faut laver les filtres après l’hybridation: variable selon l’expérience

  7. Sondes froides • Digoxigenin: une stéroïde isolé des plantes • Liaison covalent avec un nucléotide: incorporé dans une sonde comme les nucléotides normales. • Détection avec des anticorps • Utilisé le plus souvent dans les sondes ARN

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