Biochimica clinica delle malattie pancreatiche

1. Biochimica clinica delle malattie pancreatiche

2. Pancreatite acuta • Flogosi acuta dall’eziologia varia (malattie vie biliari, alcool, dislipidemie, iperparatiroidismo, infezioni virali ecc.) • Criteri diagnostici: • Dolore, in genere violento in zona epigastrica • Elevazione dei livelli ematici degli enzimi pancreatici • Evidenza di pancreatite acuta da imaging, laparotomia e/o autopsia • Spesso quadro di shock • Mortalità fino al 10%

3. FUNZIONI DEL PANCREAS • Pancreas esocrino • digestione lipidi • “ proteine • “ glucidi • “ acidi nucleici • Pancreas endocrino • metabolismo glucidico

4. Endocrina Insulina & proinsulina ( cells) Glucagone ( cells) Pancreatic polypeptide (F cells) Somatostatina ( cells) Gastric inhibitory polypeptide Secretina, gastrina, bombesina Esocrina(dalle cellule degli acini) Amilasi Lipasi Tripsinogeno, chimotripsinogeno Procarbossipeptidasi A e B Proelastasi, ribonucleasi, desossiribonucleasi Profosfolipasi A2 Secrezioni Pancreatiche

5. -AMILASI • Digestione dei polisaccaridi (amido, glicogeno), idrolizza il legame 1,4 -glicosidico fino a formare maltosio. Dato il basso PM (40.000 D) penetra all’interno della grossa molecola dell’amido spezzandola prima in piccoli frammenti (destrine). • Fisiologicamente >99% dell’enzima è secreto nel duodeno. • Emivita plasmatica breve: 9.3 - 17.7 ore • Eliminato per filtrazione glomerulare, il 50% è riassorbito dal tubulo. • Necessita di ioni Ca++ per la sua attività catalitica

6. -AMILASI • Prodotta principalmente dalle ghiandole salivari e dal pancreas esocrino. Nel soggetto sano l’-amilasi sierica è per il 50% circa di provenienza salivare e 50% pancreatica. • Elevatissima omologia tra i 2 isoenzimi (97%). • Intervalli di riferimento : adulti amilasi totale 28 - 100 U/L amilasi pancreatica 13 - 53 U/L nei neonati non c’è amilasi pancreatica; compare dopo 1- 2 mesi di vita e raggiunge i livelli degli adulti dopo i 5 anni.

7. -Amilasi C 5 4 3 2 1 punto di clivaggio Meccanismo d’azione dell’amilasi Polisaccaride

8. L’amilasi nella pancreatite acuta • Un incremento si verifica entro 5 - 8 ore dall’insorgenza dei sintomi. • Un aumento di 4 – 6 volte il limite superiore dell’intervallo di riferimento è comune. • Il picco ematico è raggiunto in 12 – 72 h. • I livelli ritornano nella norma entro il terzo o il quarto giorno.

9. Pancreatiche pancreatite acuta poussée di pancreatite cronica trauma pancreatico pseudocisti pancreatica carcinoma del pancreas ostruzione del dotto pancreatico o della papilla Non pancreatiche affezioni vie biliari ulcera peptica ostruzione intestinale gravidanza ectopica parotite CAUSE DI IPERAMILASEMIA ACUTA E SUBACUTA

10. CAUSE DI IPERAMILASEMIA CRONICA • Insufficienza renale (a partire da clearance della creatinina <50 ml/min). • Macroamilasemia. • Tumori maligni (di solito amilasi salivare, per attivazione del gene). • Alcoolismo (aumento della amilasi salivare, anche se solo nel 10% dei casi l’amilasi totale è aumentata). • Patologie epatiche (l’amilasi è presente, anche se in quantità limitate, negli epatociti).

11. MACROAMILASI • Deriva da complessi -amilasi - immunoglobuline (soprattutto IgA). • Prevalenza fra lo 0.1% (popolazione generale) ed il 2% (paz. ospedalizzati). • L’elevato PM (>400 kDa) ne preclude l’eliminazione renale  livelli plasmatici elevati (fino a 4 volte la norma) accompagnati però da livelli urinari normali o ridotti.

12. METODI DI DETERMINAZIONE DELL’-AMILASI • Substrato naturale: amido (metodi storici) • riduzione della torbidità della soluzione • riduzione della viscosità della soluzione • cambiamento del colore (in presenza di iodio) • misura del glucosio formatosi • Substrati sintetici: • amido legato a coloranti • polimeri del glucosio (catene da 3 a 7 molecole) legate ad una molecola di paranitrofenolo La liberazione del colorante o del paranitrofenolo causa una variazione del colore della soluzione e permette la determinazione cinetica dell’attività dell’enzima.

13. Amilasi pancreatica • Misura: inibizione dell’attività dell’isoenzima salivare mediante due diversi anticorpi monoclonali; veloce e precisa. • Maggiore specificità rispetto all’amilasi totale • Rimane elevata più a lungo • Utilizzabile anche per la diagnosi dell’insufficienza pancreatica (se < I.R.) • L’unica rilevante indicazione alla misura dell’-amilasi è la patologia pancreatica; non ci sono indicazioni cliniche per la misura dell’amilasi salivare.

14. ISOAMILASI SALIVARE MAB 66C7 NESSUNA REAZIONE MAB 88E8 SUBSTRATO ISOAMILASI PANCREATICA MAB 66C7 MAB 88E8 Amilasi pancreatica, metodo immunoinibizione

15. LIPASI • La concentrazione nel secreto duodenale è 500 - 800 volte più elevata di quella ematica. • Emivita molto breve 6.9 - 13.7 ore, escreta a livello renale è completamente riassorbita a livello del tubulo dove viene degradata. Non è misurabile nelle urine. • I livelli plasmatici nel sano sono molto bassi, a volte non misurabili; la valutazione dei suoi livelli () nel corso di pancreatite cronica non è quindi utile dal punto di vista diagnostico.

16. Lipasi: meccanismo di azione (1)

17. Lipasi: meccanismo di azione (2) 2,3-Digliceride 2-Monogliceride Emulsione di trigliceridi 1,2-Digliceride

18. METODI DI DETERMINAZIONE DELLA LIPASI PANCREATICA Substrato naturale (emulsione di trigliceridi) • metodi titrimetrici: titolazione con indicatore, pH - stat, pH-metria differenziale • metodi turbidimetrici o nefelometrici • metodi colorimetrici: determinazione degli acidi grassi liberati

19. METODI DI DETERMINAZIONE DELLA LIPASI PANCREATICA Substrati artificiali • 1-oleil-2,3diacetoilglicerolo (lastrine Vitros): la lipasi stacca l’ac. oleico, quindi un’esterasi stacca il glicerolo che è misurato enzimaticamente. • 1,2 dilinoleilglicerolo: a) misura degli ac. grassi liberati mediante gli enzimi del ciclo della -ossidazione; b) misura enzimatica del glicerolo liberato. • 1,2-O-dilauril-rac-glicero-3-glutarato-(6’ metilresorufina)-estere: la lipasi stacca dal glicerolo l’estere dell’acido glutarico con la metilresorufina, questo composto è instabile e libera metilresorufina (colore blu letto a 580 nm).