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Principi di Oncologia Sperimentale

Principi di Oncologia Sperimentale. METASTASI SPERIMENTALI RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO IN VITRO 4° S. Beninati. METASTASI SPERIMENTALE. Il processo metastatico può essere riprodotto sperimentalmente e quindi suddiviso nelle fasi che lo compongono.

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Principi di Oncologia Sperimentale

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Presentation Transcript

  1. Principi di Oncologia Sperimentale METASTASI SPERIMENTALI RIPRODUZIONE DEL PROCESSO METASTATICO IN VITRO 4° S. Beninati

  2. METASTASI SPERIMENTALE • Il processo metastatico può essere riprodotto sperimentalmente e quindi suddiviso nelle fasi che lo compongono. • In tal modo è possibile studiare i diversi momenti dell’invasione metastatica riducendo le possibili variabili. • L’osservazione diviene facilmente interpretabile, permettendo di definire il bersaglio della ricerca

  3. Farmaci antineoplastici • Una molecola o un insieme di molecole si definisce antineoplastica quando esercita una azione tesa ad inibire lo sviluppo e la disseminazione delle cellule tumorali. • Il termine antineoplastico è generico poiché non specifica quale fase della crescita tumorale viene colpita dalla molecola.

  4. Antiproliferativo o antimetastatico? • Un tumore può essere altamente proliferante ma con bassa metastaticità (questa condizione è presente anche nei tumori benigni) • Al contrario può essere altamente metastaticio ma con bassa proliferazione • Può anche possedere le due caratteristiche assieme

  5. Modelli sperimentali • Al fine di studiare quale fase del processo tumorale viene influenzata dalla molecola in esame, si utilizzano modelli sperimentali. • Si distinguono come: • 1. modelli multivariabile (poiché comprendono più fasi del processo) • 2. modelli monovariabile (poiché viene valutata una singola fase del processo)

  6. Camere di Boydenun esempio di modello multivariabile • Le camere di Boyden rappresentano un modello sperimentale multivariabile, poichè riproduce i seguenti passaggi: • 1.adesione • 2. rilascio di metalloproteasi • 3.invasione • Tale modello quindi permette di valutare il potere metastatico nelle tre variabili citate

  7. ADESIONE Le cellule tumorali aderiscono al substrato (Matrigel) PROTEOLISI Secrezione di matalloproteasi che idrolizzano il Matrigel

  8. INVASIONE Superata la barriera del Matrigel le cellule tumorali invadono il compartimento sottostante

  9. Modelli monovariabile • I modelli monovariabile permettono di discriminare i singoli passaggi del processo metastatico. • Si effettuano in vitro utilizzando cellule di una linea tumorale metastatica e in vivo utilizzando topi o ratti. • Con questi modelli è possibile valutare l’effetto di un farmaco su di una o più fasi del processo metastatico.

  10. Modelli sperimentali in vitro • Essi permettono di valutare: • proliferazione • adesione • migrazione • Invasione

  11. Modelli sperimentali in vivo • Permettono di valutare due parametri: • proliferazione • Colonizzazione/invasione

  12. Modelli in vitro: Proliferazione • La proliferazione cellulare è legata a cinque fasi della vita della cellula: • Il ciclo di crescita • Il ciclo cellulare • La divisione cellulare • Il differenziamento • Morte cellulare (Apoptosi e/o Anoikis)

  13. Il ciclo di crescita • IL CICLO DI CRESCITA CONTROLLA MOLTI PASSAGGI CHE SONO NECESSARI PER LA COLTURA DI CELLULE ANIMALI. • LA DENSITÀ CELLULARE DI SEMINA IL TEMPO DI CRESCITA LA DURATA DI UN ESPERIMENTO IL MOMENTO ADATTO PER IL PRELIEVO DEI CAMPIONI IL METABOLISMO CELLULARE

  14. Il ciclo cellulare

  15. La divisione cellulare

  16. % proliferation * Time (hrs) Proliferazione cellulare in presenza di farmaci antineoplastici

  17. Il differenziamento • Nelle linee cellulari utilizzate, il differenziamento può essere rivelato osservando alcuni markers specifici. • Nelle linee di melanoma l’aumentata produzione di melanina è segno di differenziamento

  18. µg melanin/mg protein Control AE 48h AE 72h Linea cellulare B16-F10

  19. Morte cellulare (Apoptosi) • il termine apoptosi indica una forma di morte cellulare programmata. • Si tratta di un processo ben distinto rispetto alla necrosi cellulare, e in condizioni normali contribuisce al mantenimento del numero di cellule di un sistema.

  20. Una cellula in apoptosi. In uno dei molti scenari apoptotici, il processo è stimolato da una cellula adiacente; la cellula morente espone in seguito segnali che richiamano dei macrofagi

  21. Percentuale di cellule in apoptosi misurata con il citofluorimetro (evidenzia il numero di cellule in una certa fase del ciclo cellulare)

  22. Cellule apoptotiche

  23. Cellule in apoptosi

  24. Cellule in apoptosi

  25. Morte cellulare (Anoikis) • Anoikis rappresenta l’apoptosi indotta da uno scorretto attacco delle cellule alla matrice extracellulare (ECM). • E’ il meccanismo attraverso il quale le cellule in vivo utilizzano segnali che derivano dal ECM per mantenere l’integrità dei tessuti. • Leggere: Gilmore A.P. Cell Death and Differentiation (2005)12,1473

  26. Modelli in vitro:adesione • Il primo passo per lo stravaso delle cellule tumorali è l’adesione alle cellule endoteliali, mediato da molecole di adesione cellulare (cell adhesion molecules – CAMs), che comprendono la famiglia I-CAM ed N-CAM (integrine), lectine di superficie cellulare e glicoproteine che si legano alle lectine espresse dalle cellule.

  27. Adesione e sedi vascolari • La selettività per specifiche sedi vascolari è legata ai meccanismi di adesione alle pareti vasali. • Ma anche al tipo di enzimi degradativi prodotti dalla cellula neoplastica e di enzimi inibitori presenti nel tessuto invaso • Contribuiscono anche fattori chemiotattici e aptotattici che guidano l’insediamento della singola cellula nei siti ottimali per la proliferazione, ai fattori di crescita autocrini e paracrini e alla possibilità di iniziare e mantenere il processo angiogenico.

  28. Si utilizzano piastre da 96 pozzetti il cui fondo è rivestito con collagene, laminina o fibronectina Le cellule da saggiare vengono piastrate nei pozzetti e incubate per 2 ore a 37 C°. Dopo aver rimosso il mezzo di coltura si aggiunge un colorante vitale e quindi incubate per altri 10 minuti a temperatura ambiente Test di adesione cellulare in vitro

  29. N° adherent cells Adhesion(Matrigel adhesion assay)

  30. Modelli in vitro:migrazione • Il monostrato cellulare quando danneggiato, risponde alla distruzione del contatto cellula-cellula e alla produzione di fattori di crescita nel punto danneggiato, cercando di rimarginare la ferita per mezzo sia della proliferazione che della migrazione. • Questi processi riflettono il compartamento di ogni singola cellula, ma anche quello di tutta la popolazione cellulare.

  31. Wound Healing assay • Il tipico “Wound Healing assay”, (WHM) si ottiene graffiando la superfice di una coltura cellulare alla confluenza, usando l’ago di una siringa o la punta di una pipetta. • Il monostrato cellulare cerca di sanare la ferita in tempi relativamente brevi (da 3 a 48 ore). • Il processo può essere quantificato con l’analisi di immagine computerizzata sotto osservazione al Microscopio Ottico

  32. CONTROLLO TEMPO 0 48 ORE Migration (Wound Healing Migration Assay) *

  33. % migration C ontrol AE Migration (Wound Healing Migration Assay) *

  34. circular wound-healing (CWA) • Una variazione del “Wound Healing Migration Assay” è il CWA. • In questo caso si utilizza una punta di silicone ruotante per creare una ferita circolare uniforme, in un momolayer di cellule alla confluenza.

  35. circular wound-healing (CWA)

  36. Modelli in vitro: invasione L’invasione di cellule tumorali può essere valutata con il “3D invasion/morphogenic assay” oppure con il “Circular invasion assay”.

  37. 3D invasion/morphogenic assay Nel 3D invasion/morphogenic assay le cellule sono immerse in una matrice gelatinosa che mima la matrice extracellulare. Il modello si definisce tridimensionale poiche le cellule possono migrare nelle tre dimensioni dello spazio. Al fine di valutare la capacità invasiva vengono contate le estroflessioni cellulari dopo un certo periodo di tempo

  38. matrice gelatinosa

  39. Control 48h 72h (3D invasion/morphogenic assay)

  40. N° of processes / cell Control AE 48h AE 72h (3D invasion/morphogenic assay)

  41. Circular invasion assay (CIA) • Il “circular invasion assay” (CIA) si è sviluppato recentemente (2007) per sostituire il classico in vitro “wound-healing assays” e altre tecniche per lo studio della migrazione e invasione nelle metastasi.

  42. Circular invasion assay • Anche in questo caso si utilizza una punta ruotante di silicone che crea una ferita perfettamente circolare nel monolayer cellulare. • A differenza del CWA la tecnica CIA utilizza il Matrigel che viene steso sopra la coltura cellulare, mimando la matrice extracellulare. • Il modello si avvicina molto a quello che accade in vivo l’aggiunta di Matrigel permette di valutare la reale invasione. • A differenza del CWA che permette di valutare solamente la migrazione. • Comparando le dimensioni della ferita nel tempo si può quantificare l’invasione di cellule tumorali

  43. t=0 AE Control 12h 30 24h 20 % wound closure * 10 0 Control AE Circular invasion assay

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