1 / 14

Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej

Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius. Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko. Cel pracy. Konstrukcja biblioteki BAC dla genomu Lupinus angustifolius

kyrene
Télécharger la présentation

Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Biblioteka BAC genomu Lupinus angustifolius Andrzej Kasprzak Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań Pracownia Genomiki Strukturalnej prof. dr hab. Bogdan Wolko

  2. Cel pracy • Konstrukcja biblioteki BAC dla genomu Lupinus angustifolius • Charakterystyka biblioteki – czystość, średnia wielkość insertu, reprezentatywność • Wykorzystanie biblioteki – przeszukiwanie sondami EST, chromosome painting, chromosome walking

  3. Materiały • DNA Lupinus angustifolius, izolowany z jąder interfazowych stożków wzrostu korzeni, oczyszczony metodą cytometrii przepływowej • Enzym restrykcyjny HindIII • Wektor pINDIGOBAC5 (Epicentre) • Komórki kompetentne E. coli DH10B • Medium selekcyjne (CHl, X-Gal, IPTG) • Płytki do przechowywania klonów w temperaturze -80oC, 384-miejscowe

  4. Próbka Puls ładujący próbkę Detektor Źródło światła _ + Naładowana elektroda Selekcjonująca krople Naładowana elektroda Selekcjonująca krople Frakcja o ładunku dodatnim Frakcja o ładunku ujemnym Zanieczyszczenia 1. Izolacja DNA za pomocą „sortera chromosomów”

  5. 2. Trawienie DNA w niskotopliwej agarozie (HindIII, 15min, 37°C)3. Selekcja wielkości fragmentów po trawieniu PFGE: Podwójna selekcja wielkości (w buforze 0. 25 x TBE) Pierwsza selekcja: 1% żel agarozowy, 1s - 40s, 6h, 6V/cm, kąt 120° Druga selekcja: 1% żel agarozowy, 2.5s - 4.5s, 12h, 6V/cm, kąt 120°

  6. 4. Elektroelucja (1,5 h, 1xTAE, 4 V/cm, 4oC) 5. Ligacja z wektorem pIndigoBAC-5 (Epicentre)

  7. 6. Transformacja E. coli DH10B (350 V, impuls 4000, 330 F) 7. Selekcja klonów na podłożu stałym z chloramfenikolem, X-gal, IPTG Płyta typu BioAssay z transformowanymi komórkami bakteryjnymi

  8. 8. Pikowanie i inokulacja (GeneTAC G3)

  9. 9. Sprawdzenie średniej długości insertów - trawienie BAC’ów enzymem NotI - elektroforeza w pulsującym polu (1% żel agarozowy, 0,5xTBE , 1s - 40s, 16h, 6V/cm, kąt 120°)

  10. Dystrybucja wielkości insertów Procentowy udział w bibliotece Długość insertu [kbp]

  11. Obliczanie prawdopodobieństwa znalezienia dowolnie wybranej sekwencji nukleotydowej genu w bibliotece BAC - wzór Clarke’a i Carbona P - prawdopodobieństwo, że dowolna sekwencja genomowa ma odpowiednik w bibliotece N - liczba klonów (55 296) x - średnia długość insertu (100 kpz) y - wielkość genomu (920 Mpz)

  12. 10. Test czystości biblioteki – hybrydyzacja z sondami specyficznymi dla mtDNA i cpDNA łubinu Klucz odczytywania sygnałów Przykładowa hybrydyzacja z sondą mtDNA Dwa pozytywne sygnały na 18 432 klony BAC

  13. 11. Screening biblioteki sondami EST znakowanymi radioaktywnie – poszukiwanie genu ENOD40 12. Hybrydyzacja in situ wyselekcjonowanego klonu BAC

  14. Podsumowanie • Skonstruowano pierwszą bibliotekę BAC • dla genomu Lupinus angustifolius • Charakterystyka biblioteki: • - liczba klonów: 55 296 • - średnia wielkość insertu: 100 kbp • - zanieczyszczenie mtDNA: 0,018% • - zanieczyszczenie cpDNA: 0,045% • - prawdopodobieństwo znalezienia sekwencji: 99,7% • - pokrycie: 6x

More Related