Utledning av den genetiske koden

1. Utledning av den genetiske koden • Crick & Brenner 1961: Genetisk analyse av baktierofag T4-mutanter: Kodoner er tripletter • Nirenberg 1961: Polynukleotid fosforylase for syntese av polynukleotider. Poly(U) koder for poly-Phe. • Nirenberg & Leder 1964: Trinukleotider stimulerer binding av aminoacyl-tRNA til ribosomer. Kodoner for de 20 aminosyrene • Khorana: Syntese av repeterte polynukleotider. Den genetiske kode bekreftes. Stoppkodoner

2. Amino Acid Incorporation Stimulated by a Random Copolymer of U and G in Mole Ratio 0.76:0.24.

3. Aminoacyl-tRNA syntetaser • Klasse I-motiver: HIGH og KMSKS, inngår i Rossman-folden • Klasse II-motiver: Tre konserverte motiver som ligger i 7-trådet β-plate med tre flankerende helikser i kjernen av det katalytiske domene • Klasse I må gjenkjenne antikodon, flere klasse II-enzymer interagerer ikke med antikodon. • Klasse I aminoacylerer 2’OH i 3’ ende av tRNA, klasse II aminoacylerer 3’OH

5. tRNA-molekyl

6. Aminoacyl-tRNA

7. Hvilke tRNA-elementer gjenkjenner klasse I-syntetasen?

8. Viktige gjenkjenningselementer i fire tRNA

9. E. coli Gln-tRNA syntetase (klasse I) i kompleks med tRNAGln og ATP

10. Asp-tRNA syntetase (klasse II) fra gjær i kompleks med tRNAAsp og ATP

11. Forskjeller i tRNA-binding mellom klasse I- og klasse II-syntetaser

12. Plasseringen av tRNA og aminoacyladenylat på enzymet bestemmer hvilken OH-gruppe som blir aminoacylert

13. Noen aminoacyl-tRNA syntetaser har korrekturlesingsaktivitet

14. Det eukaryote ribosom • Fakta fra E.coli • 20000/bakterie • 2500 kD • 250Å diam. • 70S (30S + 50S) • 2/3 RNA + 1/3 protein • 80% av E.coli RNA • 10% av E.coli-protein • proteinsyntese

15. Sammensetning av E. coli-ribosomer

16. Sammensetning av cytoplasmatiske ribosomer fra rottelever

17. Ribosomale proteiner, E. coli • S1-S21 og L1-L31 • Nummerert etter vandring i 2D gel • S20 og L26 er felles for subenhetene, sitter i kontaktpunktet • L7/L12 samme protein +/- (N-term.) acetylering, 4 eks ialt + L10 = L8 • Alle andre proteiner i 1 eksemplar • Minste: L34, 46 aa. Største: S1, 557 aa. • Liten sekvenshomologi mellom de ribosomale proteiner (52) • Mye Lys og Arg, lite aromatiske aa (rRNA polyanionisk) • RNA-recognition motif (RRM) i 5 proteiner • RRM: 3 antiparallelle b-sheets med a-heliks mellom 2. og 3.

18. Ribosomale proteiner og rRNA assosierer uten hjelp, ”self-assembling units” Start: S4, S8, S15, S17

19. Hva gjør proteinene og rRNA • Small subunit- binding • mRNA binding: S1,S3,S4,S5, S9,S12,S18 +3’-enden av 16S rRNA • Antikodon binding i ”cleft” • Gjenkjenner og binder tRNA • Large subunit- katalyse • Peptidyltransferase:L2,L11,L15L16, L18,L23,L27 + 23S rRNA • GTPase-stalk: 4 stk L7/L12 • Peptidyltransferase i ”valley” • Membran assosiering: ved utgang av peptidkanal

20. Eukaryote vs. prokaryote • Like i struktur og funksjon - ulike i nesten alle detaljer • Varierende sekvens • Eukaryote ribosomer er: • Mye større, 80S • 40S + 60S, struktur som prokaryoter • Flere og større rRNA • 40S: 18S rRNA • 60S: 28S, 5,8S, 5S rRNA • Flere proteiner • Liten subenhet: 33 proteiner • Stor subenhet: 49 proteiner

21. Liten subenhet antikodonbinding Peptidyl- transferase Stor subenhet Polypeptidutgang Kanal: 25 X 100-120Å

22. E. coli-ribosomet, 25Å oppløsning

24. Wobble-hypotesen • 61 aminosyre-kodoner • 31 +1 tRNA • Mange tRNA binder flere kodon • Wobble-hypotesen: de to første basepar binder stringent, mens det siste tillater non-Watson-Crick baseparring (U:G, I:A) • Antikodon 3’ A----A----Gm 5’ antiparallell binding • kodon 5’ U----U----C/U 5’ • Gm (2’-metylguanosin) eller inosin er vanlig i antikodon

25. To ”wobble”-basepar, begge bekreftet ved strukturbestemmelse

26. Tillatte wobble-basepar

27. Puromycin sammenlignet med tyrosyl-tRNA

28. Foreslått mekanisme for ribosomal peptidsyntese

29. Modell av peptidyl transferase-senteret i ribosomet med substrat bundet til A- og til P-setet

30. Translasjonsinitiering hos E. coli • IF-3 fremmer dissosiasjon av 70S-ribosomet. IF-1 stimulerer dissosiasjonen, kanskje ved å bidra til binding av IF-3 • mRNA og IF-2 i ternært kompleks med GTP og fMet-tRNAfMet bindes til 30S • IF-3 frigis. 50S bindes til 30S-initieringskomplekset. IF-2 hydrolyserer sitt GTP. Dette gir en konformasjonsendring i 30S, IF-1 og IF-2 frigis

31. Initiering -fMet • Prokaryoter: fMet er første aa, metionin er formylert på NH2-gruppen • Eukaryoter: AUG - prokaryoter: AUG, GUG • fMet-tRNAfMet : samme syntetase for tRNAfMet og tRNAmMet • Formylering skjer etter tRNA kopling • Enzymet er spesifikt for Met-tRNAfMet • N10-formyltetrahydrofolat er metyldonor • fMet deformyleres eller fjernes helt post-translasjonelt

32. tRNAfMet, forskjeller sammenlignet med normalt tRNA

33. Translasjonsinitiering hos pattedyr: minner om prokaryot initiering, men mer komplisert

34. Initiering – prokaryoter vs. eukaryoter • Prokaryot • IF-1, IF-2, IF-3 • fMet • Shine-Delgarno sekvens • Mono- and polycistronisk mRNA • Proteinstart ved definert AUG • Kan translatere sirkulært mRNA • Eukaryot • eIF-n, n>10 • Ingen fMet • Ingen Shine-Delgarno • Monocistronisk mRNA • Proteinstart = første AUG • Kan ikke translatere sirkulær mRNA • eIF-4E er cap-bindende protein, som hjelper 40S å starte scanning av mRNA

35. Ribosombindingssekvenser i prokaryot mRNA (Shine-Delgarno-sekvenser)

36. Forlengelsessyklus for E. coli-ribosomer (E-setet ikke vist)

37. Peptidforlengelse, skjematisk

38. Elongering - EF-Tu’s rolle • Øker hastigheten i amino-tRNA binding - koster GTP • Forlater aa-tRNA komplekset når det sitter i A-setet bundet til kodon på mRNA • Utgjør 5% av E.coli protein, ca 100.000/bakterie • ”Alle” aa-tRNA er bundet til EF-Tu/GTP • EF-Tu/GDP regenereres: EF-Ts erstatter GDP og GTP erstatter EF-Ts • Binder ikke tRNAfMet med Met eller fMet pga manglende basepar i aminoarmen

39. Regenerering av EF-Tu • Tilhører familien av GTP-bindende proteiner • Felles strukturelt motiv som: • binder GTP/GDP • hydrolyserer GTP • Aktivitet avhengig av • GTPase aktiverende protein (GAP) - for EF-Tu er det ribosomet. • GTP hydrolyse => stor konformasjonsendring i EF-Tu • guaninnukleotid-frigjøringsfaktor (GRF)- for EF-Tu er det EF-Ts

40. Elongering - 3-trinns syklus • Binding (decoding), transpeptidering, translokasjon • 40 aminosyrer inkorporert/sekund • Ikkeribosomale elongeringsfaktorer:EF-Tu, EF-Ts, EF-G • GTP hydrolyseres til GDP ved binding og translokasjon

41. Translokering - 2-trinns prosess • Tom tRNA overføres til E-setet E P A • Peptidyl-tRNA overføres fra A- til P-setet • Non-ribosomal elongeringsfaktor: EF-G • EF-G bindes i kompleks med GTP • EF-G/GTP binding hindrer EF-Tu/GTP binding • Fjerning av EF-G/GTP krever hydrolyse av GTP og er samtidig startsignal for binding av ny aa-tRNA i A-setet • EF-G tilhører familien av GTP-bindende proteiner, men er sin egen GRF

43. Termineringsreaksjonen i E. coli-ribosomer • RF-1 gjenkjenner UAA og UAG • RF-2 gjenkjenner UAA og UGA • Hos eukaryoter bindes en enkelt frigjøringsfaktor, eRF, til ribosomet sammen med GTP

44. Prokaryot vs. eukaryot • Prokaryot • RF-1, RF-2, RF-3(GTP) • Eukaryot • eRF(GTP)

45. Frigjøringsfaktorene ligner på tRNA men bindes ikke nødvendigvis til ribosomet på en måte som utnytter likheten…

46. Hva er GTP’s funksjon • Hastighet • Translasjon kan finne sted uten GTP - svært langsom • IF-2/GTP, EF-Tu/GTP, EF-G/GTP, RF-3/GTP • Ingen høy-energi intermediater • Binding av GTP-bindende proteiner m/GTP til ribosomet => allosterisk forårsaket konformasjonsendring • GTP => konformasjonsendring • GDP + Pi => avslapning • GTP hydrolysen er rask og irreversibel => tilknyttede reaksjoner blir det også

47. Hva er GTP’s funksjon • Nøyaktighet • Kinetisk feilsøking • Binding skjelner mellom ”cognate” og ”non-cognate” kodon-antikodon interaksjon vha bindingsenergi • GTP hydrolyseres, danner GDP intermediat med diss. konstant k3 • Non-cognate k4 antas > cognate k4 • Hvis k3>k4 => peptidbinding lages • Hvis k4>k3 => ingen peptidbinding