Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS molekulas baktēriju šūnā pastāv superspiralizētā formā.

1. Plāzmīdu DNS superspiralizācijas ietekmē uz tājās klonētu gēnu ekspresijas līmeni Escherichia coli šūnās Jana Sočņeva Gaļina Makarenkova Irina Sominska LU MIKROBIOLOĢIJAS UN BIOTEHNOLOĢIJAS KATEDRA LU BIOMĒDICINAS STUDIJU UN PĒTĪJUMU CENTRS

2. Lai gan DNS divpavedienu struktūra tika noskaidrota jau pirms piecdesmit gadiem, priekšstati par tās topoloģijas lomu šūnā notiekošo procesu regulācijā veidojās samērā nesen.

3. Gredzenveida divpavedienu plazmīdu DNS molekulas baktēriju šūnā pastāv superspiralizētā formā. • DNS superspiralizācija var but pozitīva un negatīva. . • Superpiralizācijas pakāpe var mainīties: • DNS replikācijas laikā • topoizomerāžu iedarbības rezultāta • DNS molekulai apvijoties ap proteīniem – piemērām RNS polimerāzi.

4. DNS superspiralizācijai ir liela loma daudzos šūnā notiekošajos procesos. • Transkripcijas un replikācijas laikā plazmīdu DNS superspiralizācijas pakāpe mainās =plazmīdu superspiralizācijas pakāpe ietekmē gēnu ekspresijas līmeni baktēriju šūnās. • Tomēr DNS superspiralizācijas izmaiņas biotehnoloģiskiem mērķiem izmantojamās baktēriju kultūrās ir maz pētītas.

5. DNS superspiralizācija E. coli šūnās tiek regulēta kā kopējas šūnas homeostāzes daļa. • Rekombinanatajos baktēriju celmos kuri tiek izmantoti dažadu svarīgu un vajadzīgu proteinu ražošanai bieži novērojamas nekontrolētas klonēto proteīnu gēnu ekspresijas izmaiņas, kuras nav saistītas: • ar plazmīdasmutācijām; • ar saimniekšūnas mutācijām • ar būtiskām izmaiņām šūnu augšanas fizioloģiskajos raksturlielumos.

6. Par modeļobjektu pētnieciska darba izstrādāšani tika izmantoti klonētucilvēkainterferona IFN – a5 • gēnu nesošas plazmīdas - pIF564 • delēciju varianti, kuru interferona • sintēzes spējas savstarpēji būtiski atšķīrās. • IFN – a5 gēnu izolēja no hromosomālās DNS bibliotēkas kā zondi izmantojot nepilnīgas cDNS klonu (K.Henco, J. Brosius 1985). • Šī darba mērķis bija noskaidrot, vai plazmīdu DNS superspiralizācijas pakāpe ietekmē rekombinanta cilvēka interferona IFN – a5 sintēzi baktērijas Escherichia coli šūnas.

7. E.coli TG1 un XL Blue MR celmiem pIF564 plazmīdu un tas delēcijas variantiem pIF693, pIF724 pIF728, pIF731, pIF733, pIF736, pIF803, pIF818, Darba gaitā tika strādāts ar: pIF564

8. Plazmīdu superspiralizācijas blīvuma mērījumi XL pIF693 6h 10h 24h TG1 pIF693 6h 10h 24h

9. Plazmīdas pIF564 un tas delēciju variantu DNS superspiralizāciju ietekmē: Baktēriju saimniekšūnu ģenētiskais fons un fizioloģiskais stāvoklis

10. Novērota korelācija starp rekombinanto plazmīdu superspiralizāciju un IFN - 5 proteīna ekspresijas līmeni – proteīns tiek sintezēts E. coli TG1 celmā, kur plazmīdas ir vairāk superspiralizētas un lielākā skaitā neka XL Blue MR celmā, kur IFN sintēze praktiski nav novērojama

11. Proteīna uzkrāšanas notiek sākot ar 15 – 24 stundu, sintēze efektīvāk notiek šūnās, kur plazmīdas šajā laikā ir vairāk relaksētas nekā šūnās, kur plazmīdas ir ilgāk saglabājušas lielu superspiralizācijas blīvumu Rekombinānto plazmīdu superspiralizācijas izmaiņas (Rf) E. coliTG1 augšanas ciklā Rekombinanta IFN - α5 produktivitāte Tg1 celmā kultūras augšanas ciklā

12. Ievērojot to, ka pētītās plazmīdas izmantotie replikācijas un gēnu ekspresijas regulācijas elementi ir identiski, var secināt, ka gēnu ekspresijas efektivitātes atšķirības vienā un tajā baktēriju celmā ir atkarīgas no replikona topoloģijas (superspiralizācijas) īpatnībām. 

13. Par modeli tālākiem pētījumiem DNS superspiralizācijas lomas noskaidrošanai uz klonēto gēnu ekspresiju tika izvēlēts HBVc antigēna gēns. HBV kora proteina - HBVc • Šīs proteīns spontāni savācas un veido 27nm kora daļiņas pat bez citu HBV proteīnu klātbūtnes. • Šīs HBc proteīns ir imunogēns un inducē organisma augstu anti-HBc titru HBV infekcijas laikā ka arī imunizējot dzīvniekus.

14. HBV - Kora proteins - HBc

15. Darbā tika izmantots HBc pilna garuma savvaļas fenotipa un HBc saīsinātais gēna variants. • Tie tika veiksmīgi ieklonēts pTVI un pIF693 (labākās IFN - 5 producēts) plazmīdas EcoRI saitā, IFN - 5 vietā. Ka rezultāta tika iegūtās jaunas konstrukcija. • Tika pārbaudīts arī HBc pilna un HBc saīsināta ekspresijas līmenis E. coli TG1 celmā.

16. Iegūto plazmīdu restrikcijas kartes pTVI+HBc full pTVI+HBc short pHBc-JA-3 pHBc-JA-1 HBc full HBc short pIF693+HBc full pIF693+HBc short pHBc-JA-2 pHBc-JA-4 HBc short HBc full

17. HBc proteīna analīze SDS – PAA elektroforēzes gelā Kont. JA-1 JA-1 JA-2 JA-2 JA-3 JA-3 JA-4 20.kDa 14 kDa HBc pilna garuma 22kDa HBc saisinātais variants 15kDa

18. Paldies par uzmanību!