前言

前言 • 层析法又称色层分析法或色谱法（Chromatography），是一种基于被分离物质的物理、化学及生物学特性的不同，使它们在某种基质中移动速度不同而进行分离和分析的方法。例如：我们利用物质在溶解度、吸附能力、立体化学特性及分子的大小、带电情况及离子交换、亲和力的大小及特异的生物学反应等方面的差异，使其在流动相与固定相之间的分配系数（或称分配常数）不同，达到彼此分离的目的。

层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。层析法的最大特点是分离效率高，它能分离各种性质极相类似的物质。而且它既可以用于少量物质的分析鉴定，又可用于大量物质的分离纯化制备。因此，作为一种重要的分析分离手段与方法，它广泛地应用于科学研究与工业生产上。现在，它在石油、化工、医药卫生、生物科学、环境科学、农业科学等领域都发挥着十分重要的作用。 • 层析根据固定相基质的形式分类，层析可以分为纸层析、薄层层析和柱层析。其中纸层析是指以滤纸作为基质的层析。

薄层色谱(Thin Layer Chromatography)常用TLC表示，又称薄层层析，属于固－液吸附色谱。是近年来发展起来的一种微量、快速而简单的色谱法，它兼备了柱色谱和纸色谱的优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0.01μg）的分离；另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg的样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的物资。此外，在进行化学反应时，常利用薄层色谱观察原料斑点的逐步消失来判断反应是否完成。

实验二薄层层析法分离AMP, ADP和ATP 一、实验目的 1．学习薄层层析的基本原理和操作方法 2．DEAE-纤维素薄层层析分离鉴定核苷酸

二、实验原理 二乙氨基乙基纤维素：一纤维素，简称DEAE-纤维素，是弱碱性阴离子交换剂，在pH3.5左右解离成季胺型，带负电荷的核苷酸离子可被交换上去。各种核苷酸的结构不同，因而和DEAE-纤维素亲和力大小不同，据此达到分离的目的。

三、操作方法 1．用DEAE—纤维素的预处理：用4倍体积的水将DEAE—纤维素浸泡过夜，离心或抽干。再用1当量/升的盐酸溶液浸泡4小时（或搅拌1.5小时）。用水洗至中性或在60℃以下烘干备用。

2．铺板： 用水把经过预处理的DEAE-纤维素在烧杯里调成糊状，立即倒入干净的玻璃板上。轻轻摇动玻璃，使纤维素铺成均匀的薄层；或将糊状物倒至涂布器的槽内，用涂布器将纤维素涂成薄层（厚0.6毫米）。将玻璃板先放在水平桌面上静置片刻，再放入60℃烘箱内烘干备用。

3．点样： 在距DEAE-纤维素板一端2厘米处用铅笔轻轻划一横线，在横线中央用毛细管点样。每次点样后，用冷风吹干，每种样品点2—3次。混合物 ATP ADP AMP

4．展层： 在250毫升烧杯内倒进约1厘米深的pH3.5的柠檬酸缓冲液（约30毫升）。把点过样的薄板倾斜插入此烧杯内（点样端在下）溶液由下而上流动，当溶剂前沿到达距薄板上端约1厘米处时（25分钟左右），取出薄板，用热风吹干，用波长254毫微米的紫外灯照射DEAE—纤维素薄层，核苷酸斑点为暗区。

薄层层析操作要点 • 铺板铺板用的匀浆不宜过稠或过稀：过稠，板容易出现拖动或停顿造成的层纹；过稀，水蒸发后，板表面较粗糙。匀浆的稀稠除影响板的平滑外，也影响板涂层的厚度，进一步影响上样量。涂层薄，点样易过载；涂层厚，显色不那么明显。板表面应均匀，平整，无麻点、无气泡、无破损及污染，

点样尽量用小的点样管。这样，点的斑点较小，展开的色谱图分离度好，颜色分明。若因样品溶液太稀，可重复点样，但应待前次点样的溶剂挥发后方可重新点样，以防样点过大，造成拖尾、扩散等现象，而影响分离效果。点样时必须注意勿损伤薄层表面.

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