CHMI 2227F Biochimie I

1. CHMI 2227FBiochimie I Purification et caractérisation des protéines CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

2. Purification des protéines • Les protéines sont toujours retrouvées en tant que composantes d’un mélange complexe incluant d’autres macromolécules biologiques; • Alors que certaines protéines sont très abondantes (anticorps sanguins), d’autres ne sont rencontrés qu’en quantités très infimes (quelques molécules par cellule); • La première étape dans l’étude de la structure/fonction d’une protéine sera donc toujours sa purification; • À partir d’un échantillon biologique contenant la protéine d’intérêt, on effectue une série d’expériences effectuées séquentiellement qui permettront progressivement d’obtenir la protéine désirée sour forme « pure »; • La purification d’une protéine est grandement facilitée si on connaît au départ: • Les caractéristiques physico-chimiques générales de la protéine: Mr, pI, solubilité; • Si une méthode expérimentale permet de détecter la présence de la protéine (réactifs, réaction enzymatique, effect physiologique, etc). CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

3. Extrait protéique brut Homogénéisation Étapes de purification grossières • Détection de la présence • de la protéine d’intérêt: • Activité • Pureté • Quantité PURE! (bon, bin, j’espère…) Chromatographie 1, 2, 3….x étapes Purification des protéines Procédure générale CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

4. Purification des protéines 1. Méthodes grossières • Basées sur la solubilité de la protéine d’intérêt sous différentes conditions: • pH • Température • Force ionique (i.e. concentration en sels); • L’idée de base est d’utiliser des conditions expérimentales qui feront précipiter beaucoup de protéines de notre extrait brut, tout en laissant notre protéine d’intérêt en solution; • Permet de nous débarrasser d’une bonne partie des «cochonneries » présentes dans l’extrait brut; CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

5. La solubilité des protéines est rendue possible par des interactions entre les chaînes latérales et le solvant: Si le solvant est l’eau: Liaisons hydrogène Interactions électrostatiques Si le solvant est non-polaire: Interactions hydrophobes; Ces interactions peuvent être modifiées en changeant la charge nette de la protéine, donc en modifiant le pH du solvant; De manière générale, les protéines précipitent lorsque le pH de la solution est égal au pI de la protéine: Les protéines s’aggrègent et formeront des agglomérats qui précipiteront. solubilité pH pI Précipitation différentielle1.1. Précipitation par modification du pH CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

6. La solubilité des protéines peut aussi être modifiée en altérant la concentration de sel dans l’extrait; Les sels ajoutés prendront la place de l’eau autour de la protéine; Les sels neutraliseront les charges des chaînes latérales de la protéine; Ces deux evènements favoriseront l’aggrégation et la précipitation des protéines; Généralement, le « salting out » est fait par l’ajout de sulfate d’ammonium: (NH4)2SO4 Plus soluble dans l’eau que le NaCl; Requiert une quantité moins grande que le NaCl pour précipiter les protéines. Une protéine donné précipitera généralement lorsqu’une concentration spécifique de (NH4)2SO4 est atteinte; Ceci permet de nettoyer notre extrait brut de manière séquentielle; Les protéines précipitées sont alors jetées à la poubelle, ou sujettes à la dialyse (pour enlever le sel de l’échantillon); http://www.tulane.edu/~biochem/med/pure.htm Précipitation différentielle1.2 «Salting out » CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

7. Précipitation différentielle1.2.Salting out PRECIPITATION!! CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

8. Centrifugation: Séparation selon la densité; Les molécules denses (i.e. grosses) vont sédimenter (former un culot) plus vite que les molécules moins denses (i.e. plus petites); Mélange de protéines dans un tampon: A: précipite à [ ] sel = 15% B: précipite à [ ] sel = 25 % C: précipite à [ ] sel = 35% • Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 20% • Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées Culot: protéine A Surnageant: protéines B + C • Ajoute (lentement) (NH4)2SO4 à 30% • Centrifuge pour récupérer les protéines précipitées Culot: protéine B Surnageant: protéine C Précipitation différentielle1.2.Salting out CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

9. Centrifugation • Technique très utilisée permettant de séparer des substance via l’application d’une force centrifuge; • L’intensité de la force centrifuge devant être appliquée varie selon la nature de la substance à séparer: • 500 x g pour cellules entières • 15 000 x g pour les mitochondries • 150 000 x g pour les ribosomes Note: 1 x g = force gravitationnelle terrestre au niveau de la mer (~ 9.8 m/s2) • Les substances particulaires vont atteindre le fond du tube (i.e., elles forment un culot) • Le liquide résiduel est appelé le surnageant. • Peut aussi être utilisé pour séparer des substances particulaires de densité différente (les substances plus denses sédimenteront plus rapidement que celles qui sont moins denses. • e.g. séparation des érythrocytes et leucocytes CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

10. Parce que le sel ajouté pour le « salting out » inhibe l’activité des protéines, il doit être enlevé avant de continuer la purification; Ceci est fait par dialyse; La solution de protéine est simplement introduite dans un sac fabriqué d’une membrane semi-perméable: Perméable aux petites molécules (e.g. sels); Imperméable aux protéines; Permet aussi de changer de tampon avant de procéder à l’étape suivante. Heures Dialyse CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

11. Après avoir utilisé des méthodes grossières afin de concentrer notre protéine favorite, on utilise des méthodes plus raffinées afin de purifier notre protéine le plus possible; Ceci est fait généralement en utilisant différents types de chromatographie: Échange d’ions; Tamisage moléculaire; Affinité Ceci est fait généralement en utilisant la Fast Protein Liquid Chromatography (FPLC). Réservoir de tampon Colonne Injecteur (échantillon) Collecteur de fractions Pompes Purification des protéines2. Méthodes fines CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

12. Permet de séparer les protéines selon leur charge Le mélange de protéines est placé dans un tampon dont le pH permet à notre protéine d’avoir une charge précise; Le mélange est ensuite déposé sur la colonne de séparation; Échange de cations: Phosphocellulose Carboxyméthyl (CM) cellulose Échange d’anions: Diéthylaminoéthyl (DEAE) cellulose Purification des protéines2.1. Chromatographie à échange d’ions CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

13. Même si un changement de tampon avec un pH différent permettrait d’éluer la protéine d’intérêt, ceci est rarement effectué car le changement de pH pourrait dénaturer la protéine ou, pire, la faire précipiter; L’élution est faite en ajoutant un tampon contenant une concentration de sel (NaCl) qui empêche la protéine de lier la colonne; L’élution peut être faite à l’aide d’un gradient linéaire de concentration de sel, ou par étapes; Adsorption Desorption NaCl Anion exchanger Exemple de chromato. à échange de cations Purification des protéines2.1. Chromatographie à échange d’ions CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

14. Changement linéaire de concentration de NaCl Ajoute tampon Changement brusque de concentration de NaCl Purification des protéines2.1. Chromatographie à échange d’ions CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

15. Aussi appelé chromatographie par filtration sur gel ou chromatographie d’exclusion; Consiste en de petites billes contenant des pores d’une taille spécifique: Les protéines plus grosses que les pores n’entrent pas dans les billes, ont moins de volume à traverser et vont éluer en premier; Les protéines plus petites que les pores vont entrer dans les billes de leur élution sera retardée: elles élueront donc plus tard.; Les protéines sont séparées selon leur masse moléculaire; La disponibilité de différents types de billes possédant des pores de différentes tailles permet la sélection du matériel de chromatographie qui donnera le meilleur résultat; Purification des protéines2.2. Tamisage moléculaire CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

16. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D. http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep_Prod~SelGuides~Media~GFSelG

17. La filtration sur gel a plusieurs applications: 1) Purification des protéines 2) Désalage PAS la même chose que le salting out; Les pores sont si petits que toues les protéines éluent rapidement et seuls les selsvoient leur élution retardée;; 3) Détermination de la masse moléculaire: Nécessite d’abord la calibration de la colonne avec des standards protéiques (un mélange de protéines de Mr connu); Permet de déterminer si la protéine d’intérêt fait parti d’un complexe multimérique. POURQUOI? Purification des protéines2.2. Tamisage moléculaire CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

18. Purification des protéines2.3. Chromatographie d’affinité • Dans ce type de chromatographie, des billes sont couplées à une molécule appelée ligand qui a la propriété de lier uniquement la protéine d’intérêt; • Ligand: anticorps, substrat, métaux, autre macromolécule pouvant lier la protéine d’intérêt. • Lorsqu’un mélange de protéines est filtré dans cette colonne, seule la protéine d’intérêt sera retenue: les autres protéines contaminants seront éluées; • La protéine d’intérêt est alors récupérée par l’ajout d’un excès du ligand libre à la colonne; • C‘est une méthode très puissante, mais avec des limites importantes: • Le milieu de séparation est très dispendieux (pas approprié pour des séparations à grande échelle) • Disponibilité limité des billes liées au ligand d’intérêt; • Nécessite la connaissance préalable du ligand pouvant lier spécifiquement la protéine d’intérêt (ce qui est rarement le cas). CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

19. Analyse des protéinesÉlectrophorèse • Pendant toutes les étapes de purification, la présence et la pureté des la protéine d’intérêt doivent être déterminés; • Aussi, on a besoin de méthodes permettant d’étudier des protéines sans avoir à les purifier; • Les méthodes les plus populaires pour analyser les protéines sont basées sur le principe de l’électrophorèse; • L’électrophorèse implique la séparation de protéines via leur migration dans un gel lorsqu’elles sont soumises à un champ électrique. • Le matériel habituel pour séparer les protéine par électrophorèse est le polyacrylamide CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

20. SDS Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS • En PAGE-SDS, les protéines sont tout d’abord placées dans un tampon contenant le détergent docécyl sulfate de sodium(SDS); • Le SDS recouvre toutes les protéines de façon similaire: on retrouvera environ 1 molécule de SDS par 2 acides aminés; • Ceci a la conséquence importante de donner à chaque protéine la même densité de charge négative, indépendamment du pI de la protéine. • Le b-mercaptoéthanol (HS-CH2-CH2-OH) est aussi ajouté fréquemment (mais pas toujours) afin de briser les ponts disulfures. • Donc, en PAGE-SDS, la seule variable qui affectera la migration des protéines dans le gel est leur taille; CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

21. Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS www.biology.ucsd.edu/classes/bggn224.FA06/crash_2.ppt http://wine1.sb.fsu.edu/bch5425/lect20/lect20.htm CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

22. Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS • Les protéines sont alors placées dans un puits du gel PAGE-SDS, et soumises à un champ électrique; • Le protéines migreront alors vers l’anode positive: la distance migrée dépendra de la taille des protéines; • Les protéines sont visualisées à même le gel grâce à un colorant bleu appelé Bleu de Coomassie; • En plaçant, dans un puits adjacent, un mélange de protéines de masse moléculaire connue (standard de protéines), on peut déterminer la masse moléculaire de la protéine d’intérêt; • À noter: le traitement au SDS et b-ME dénature les protéines et brise toutes les interactions entre protéines: la protéine migrera donc en tant que simple chaîne polypeptidique. • En certaines occasions, un PAGE NATIF est effectué: dans cette situation, on n’inclus pas le SDS ni le b-ME. Ceci permet d’étudier des protéines faisant parti de complexes multimériques. POURQUOI? CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

23. Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

24. Log Mr Distance migrée à partir du puits (cm) Électrophorèse1. Électrophorèse PAGE-SDS CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

25. Électrophorèse2. Focalisation isoélectrique • Ici, les protéines sont séparées selon leur pI; • Un mélange de protéines est placé dans les puits d’un gel d’acrylamide contenant un gradient de pH sur toute sa longueur; • En soumettant les protéines à un champ électrique, elles migreront dans le gel selon leur charge: • Protéines chargée positivement migreront vers la cathode négative; • Protéines chargées négativement migreront vers l’anode positive; • Lorsqu’une protéine atteint une zone du gel où pH = pI, elles sera neutre et arrêtera de migrer; • Cette méthode permet donc de déterminer le pI de la protéine d’intérêt; CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

26. pH in gel = pI of proteins Électrophorèse2. Focalisation isoélectrique CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

27. Ici, les protéines sont d’abords séparées en fonction de leur pI par focalisation isoélectrique. Ensuite, la bande de gel de focalisation isoélectrique est placée sur un gel de PAGE-SDS: les protéines seront alors séparées selon leur Mr; Cette méthode très puissante permet d’obtenir une très grande résolution dans la séparation de protéines présentes dans un mélange complexe. Électrophorèse3. Électrophorèse à deux dimensions CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

28. Chaque tache est une protéine Électrophorèse3. Électrophorèse à deux dimensions CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

29. Application très puissante du PAGE-SDS; Permet la détection d’une seule protéine présente dans un mélange très complexe; Basé sur la propriété des anticorps de lier une seule molécule avec une très grande affinité; Anticorps: 4 chaînes: 2 chaînes légères (25 kDa chacune) et 2 chaînes lourdes (50 kDa chacune); Chaque anticorps possède deux sites de liaison pour un même antigène (antigène: la molécule pouvant être liée spécifiquement et uniquement par l’anticorps). Structure d’un anticorps Électrophorèse 4. Analyse Western CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

30. Électrophorèse 4. Analyse Western CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

31. Purification des protéines Exemple et analyse des données • À chaque étape, on prélève 3 échantillons: • Un pour déterminer la quantité de protéines présentes; • Un pour mesurer l’activité de la protéine; • Un pour faire un gel PAGE-SDS • Le reste de la fraction est soumise à l’étape de purification suivante; CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

32. Gel de PAGE-SDS coloré au Bleu de Coomassie Purification des protéines Exemple et analyse des données CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

33. Purification des protéinesExemple et analyse des données • Informations importantes à obtenir afin d’évaluer le succès de la purification (surtout lorsqu’on met au point la méthode de purification): • Activité spécifique(unités/mg): Activité totale (U)/ Protéine totale (mg) • Rendement: (Activité totale à étape Y / Activité totale dans l’extrait brut) x 100; • Niveau de purification: Activité spécifique à l’étape Y / Activité spécifique dans l’extrait brut; CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

34. Séquençage des protéines • Toutes les propriétés structurales et fonctionnelles des protéines dépendent de l’ordre des acides aminés dans le polypeptide (sa séquence); • La structure 3-D d’une protéine est uniquement attribuable à la séquence en acides aminés de la protéine; • Plusieurs maladies héréditaires sont causées par une changement (insertion, délétion, substitution) d’un ou plusieurs acides aminés dans une protéine; • Les acides aminés importants dans la structure/fonction d’une protéine ne varient généralement pas toujours au cours de l’évolution. • La comparaison de séquences en acides aminés de protéines provenant de plusieurs espèces permet de révéler des fonctions/propriétés de la protéine d’intérêt. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

35. L’hémoglobine est un tétramère fait de 2 copies chacun de 2 polypeptides: HbA et HbB L’anémie falciforme est causée par une mutation héréditaire dans la chaîne HbB: Glu remplacé par Val Crée une région hydrophobe (pourquoi?) qui mène à l’agrégation de l’hémoglobine mutée (appelée HbS). Cette HbS agrégée forme de longs filaments qui changent la forme des érythrocytes. Ces érythrocytes allongés bloquent le flot sanguin. Ces cellules allongées sont aussi très fragiles et vont facilement éclater, causant une anémie. MAIS: parce que le parasite causant la malaria pousse dans les érythrocytes, les gens souffrant d’anémie falciforme sont plus résistant à la malaria. Globule rouge normal Globule rouge falciforme Séquence des protéines - anémie falciforme CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

36. Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes • Basé sur la propriété de réactifs chimiques/enzymes de couper le lien peptidique à un endroit très précis; NOTE: Trypsine, Chymotrypsine, protéase V8, pepsine et thermolysine ne COUPENT PAS si Pro fait partie du lien peptidique. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

37. Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 1 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

38. HCl 6M: Ala, Gly2, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr CNBr: 2 peptides sont obtenus: Peptide 1: Ala, Gly, Lys, Thr Peptide 2: Gly, Met, Ser, Tyr Trypsine: 2 peptides sont obtenus: Peptide 3: Ala, Gly Peptide 4: Gly, Lys, Met, Ser, Thr, Tyr Chymotrypsine: 2 peptides sont obtenus: Peptide 5: Gly, Tyr Peptide 6: Ala, Gly, Lys, Met, Ser, Thr FDNB: donne Gly Carboxypeptidase A: donne Gly Détermination de la séquence 1. cartographie avec enzymes – exemple 2 • Les données suivantes ont été obtenus après traitement d’un octopeptide: • Quelle est la séquence de ce peptide? CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

39. Basé sur l’utilisation du phényl isothiocyanate (aka PTC; réactif d’Edman); Le PTC réagit avec et marque l’acide aminé en N-terminal du peptide; L’acide aminé marqué au PTC est libéré du peptide et identifié par chromatographie; Plusieurs cycles de marquage et libération permettent de déterminer la séquence du peptide. Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

40. Détermination de la séquence 2. Dégradation d’Edman Identification CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

41. Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse • Technique à la mode très puissante, permettant d’identifier et de séquencer les protéines; • Les protéines sont vaporisées en fragments ionisés à l’aide d’un rayon laser; • Même des protéines coupées d’une gel PAGE-SDS peuvent être utilisées!!! • Les fragments sont séparés et leur masse moléculaire déterminée; • À partir de la masse moléculaire, le peptide peut être identifié; • En spectrométrie de masse en tandem (MS-MS), des fragments obtenus après une première ronde de MS sont sélectionnés pour une deuxième ronde de fragmentation et analyse: la masse de ces petits fragments permet de séquencer les fragments peptidiques. CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

42. Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

43. Détermination de la séquence 3. Spectrométrie de masse CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

44. Exemple de purification de protéineApoptose: un type de mort cellulaire Normale Autophagie Current Opinion in Cell Biology 2004, 16:663–669 Apoptose Nécrose CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

45. Apoptose –aspects morphologiques Shrinkage http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n3/extref/nrm2312-s1.mov Blebbing Fragmentation

46. Apoptose –aspects morphologiques http://www.nature.com/nrm/journal/v9/n3/extref/nrm2312-s1.mov

47. Apoptose et physiologie http://www.wikiwak.com/image/Celldeath.jpg

48. Exemple de purification protéiqueAcinus: une protéine impliquée dans la mort cellulaire NATURE |VOL 401 | 9 SEPTEMBER 1999 CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.

49. Condensation de la chromatine et fragmentation du noyau pendant l’apoptose Nature Reviews| molecular cell biology volume9 | march2008 | 231

50. Exemple de purification protéiqueAcinus: une protéine impliquée dans la mort cellulaire CHMI 2227 - E.R. Gauthier, Ph.D.