Chapitre 3 : Electrophysiologie et Potentiel Imposé Notion de potentiel de repos Introduction

1. Chapitre 3 : Electrophysiologie et Potentiel Imposé Notion de potentiel de repos Introduction Équilibre osmotique Notion de diffusion Diffusion simple Diffusion facilité Exemple du canal K+ Notion de gradient chimique Notion de gradient électrique Rappel sur les condensateurs Notion de gradient électrochimique et de conductance Notion de gradient électrochimique Notion de conductance Rappel sur la conductance Mesure du courant électrique appliqué à un gradient électrochimique Notion de variation de potentiel de membrane Notion de courant trans-membranbaire Méthode de Potentiel imposé

2. Gradient électrochimique et potentiel de repos des membranes excitables La membrane cellulaire peut être considérée comme un circuit électronique. La bi couche lipidique peut agir comme un condensateur Les canaux ioniques peuvent agir comme des résistances variables, Les pompes échangeuses d'ions peuvent agir comme des chargeurs de batterie. www.apteronote.com/revue/neurone/article_79.shtml

3. ++++++++++++++++++++++++ - - - - - -- - - - - -- - - - - - - - - - - - Notion de Potentiel de repos Expérience fondamentale: Potentiel de repos - 60 mV Si l'on place l'extrémité d'une microélectrode dans une cellule nerveuse, il est possible, dès l'entrée dans la cellule, d'enregistrer une différence de potentiel (ddp) par rapport au milieu extérieur d'environ 60 mV. Cette ddp, appelée potentiel de repos, est variable d'une cellule à l'autre et caractéristique de toutes les cellules vivantes. L'intérieur de la cellule est négatif par rapport à l'extérieur, ce qui s'exprime par un potentiel de repos ou potentiel de membrane (Vm) égal à - 60 mV.

4. Notion de Potentiel de repos Introduction Dans toutes les cellules eucaryotesil existe un gradient de concentration de part et d’autre de la membrane - La concentration en ions K+ est + importante à l’intérieur de la cellule qu’à l’extérieur - La concentration en ions Na+, Ca++ et Cl- est + importante à l’extérieur de la cellule qu’à l’intérieur La membrane peut permettre la diffusion de toute ou partie des ions, elle est plus ou moins sélective Les ions sont des particules chargées (q+, q-). Ils répondent donc aux lois de l’électrostatique et leurs déplacements seront influencés par la présence d’un champ électrique transmembranaire Ainsi, les conditions d’équilibre ne seront atteintes qu’après qu’un équilibre soit réalisé entre diffusion et forces électriques. Les ions vont traversé la membrane par des canaux, des pompes, qui ont la capcité de s’ouvrir et de se fermer, on parlera de probabilité d’ouverture et de fermeture qui peut dépendre des caractéristiques électriques du milieu, de neurotransmetteurs etc…

5. Notion de Potentiel de repos Potentiel d’équilibre ou de repos Principe d’équilibre osmotique et d’électroneutralité Equilibre osmotique Le nombre de particules en solution situé de chaque côté de la membrane doit être le même, quelle que soit la charge de ces particules Risque de transfert d’eau et de gonflement des cellules par exemple si équilibre osmotique non respecté

6. Notion de Potentiel de repos Notion de diffusion La diffusion simple Au travers de la membrane Du plus concentré vers le moins concentré Lent La diffusion facilitée Nécessite une protéine transmembranaire Protéine canal Du plus concentré vers le moins concentré Rapide, spécifique, régulée Transporteur Dans le sens ou contre le gradient de concentration Wikipedia

7. K+ Na+ Int EXT Cl- Ca++ 0 mV Diffusion Facilitée Considérons une membrane bicouche lipidiques

8. K+ Na+ Int EXT Cl- Ca++ 0 mV On insère un canal sélectif au K+ fermé dans un premier temps Diffusion Facilitée Considérons une membrane bicouche lipidiques ++++ ++++ - - - - - - - - Aucune différence de potentiel n’est mesurée

9. Int EXT 0 mV Notion de Gradient Chimique Considérons une membrane bicouche lipidiques On insère un canal sélectif au K+ Ouvert dans un second temps et ne laissant passer que les ions K+ ++++ ++++ - - - - - - - - Un flux net d’ions K+ du milieu Int vers le milieu Ext va s’installer

10. Notion de Gradient électrique Déficit de charge + Excès de charges + Accumulation des Cl- sur la membrane --- --- Création d’un champ électrique et donc d’une force électrostatique qui s’opposent au flux de K+ +++ +++

11. Rappel à propos du condensateur Un condensateur plan est constitué de deux surfaces parallèles et chargées, séparées d'une distance d, en face l’une de l’autre. On retrouve la notion précédente d’une plaques chargée avec ici 2 plaques dont l’une est chargée positivement et l’autre négativement • A l'intérieur d'un condensateur plan, il existe un champ électrique uniforme tel que : • E   est perpendiculaire aux plaques • il est dirigé du + vers le - (le "sens des potentiels décroissants") • sa valeur est E = U/d    avec U en V, d en m et E en V.m-1

12. Rappel Electrostatique Relation Force et champ On part du principe qu’une charge Q modifie les caractéristiques de l’espace en émettant un champ électrique a) - + - b) - - c) + - + d) + + Un champ électrique produit par une charge + (c et d) à un sens sortant de la charge + Un champ électrique produit par une charge – (a et b) à un sens entrant de la charge – Le sens de la force qu’exerce le champ est fonction du signe de la charge q et de la direction du champ Rappel

13. Des charges de même signe se repoussent du fait d’un champ électrostatique et donc d’une force éléctrostatique F=qE

14. Déficit de charge + Excès de charges + Accumulation des Cl- sur la membrane --- --- --- --- Création d’un champ électrique et donc d’une force électrostatique qui s’opposent au flux de K+ +++ +++ +++ +++

15. Déficit de charge + Excès de charges + --- --- Accumulation des Cl- sur la membrane --- --- Création d’un champ électrique et donc d’une force électrostatique qui compense le flux de K+ +++ +++ +++ +++

16. Int EXT --- --- -84 mV +++ +++ Force électrostatique qui s’opposent au flux de K+ L’équilibre est atteint quand le flux net d’ions est nul Càd quand le champ électrique compense le flux de K+ lié au gradient de concentration La ddp entre Int et Ext est alors de -84 mV

17. x x A B Notion de condensateur Rappel: un condensateur est composé de 2 surfaces conductrices appelées armatures qui s’entourent ou se font face et qui sont séparées par un isolant. Les armatures portent des charges +q et –q égales en valeur. Il est dit parfait si aucune charge ne traverse l’isolant C= capacité qui s’exprime en Farad (F) dans le SI La capacité électrique d'un condensateur se détermine en fonction de la géométrie des armatures et de la nature du ou des isolants avec S : surface des armatures en regard, d distance entre les armatures et ε la permittivité diélectrique ou représente la charge d’un condensateur La charge d’un condensateur est donc proportionnelle à la tension entre ces bornes L’intensité d’un courant électrique =

18. La membrane comme un condensateur Le principe d’électroneutralité est violé. Le départ des charges + liées au K+ provoque une augmentation de la concentration en ions – autour du canal en Int et une accumulation de charges + autour du canal en Ext (10°A autour du canal). Ceci constitue un espace étroit entre ces charges + et – séparé par la membrane qui peut être assimilé à un isolant. Un isolant et des charges + et – de part et d’autres constitue un condensateur virtuelle Ce condensateur virtuel membranaire à une capacité ou capacité membranaire Représente la quantité de charge transférée La capacité membranaire = 10.10-10 F La ddp induite entre Int et Ext La quantité de charge transférée est donc de 84.10-13 C Or le nombre d’ions = = ions K+ transférés de Int vers Ext ce qui est négligeable au regard des 1020 ions de K dans Int -- -- ++ ++

19. Equation de Nernst pour une membrane perméable à un seul ion par exemple le canal potassium A l’équilibre il existe donc une différence de potentiel. Dans le cadre d’une membrane perméable à un seul ion cette différence de potentiel est appelé potentiel d’équilibre de l’ion donné V=-84mV = potentiel d’équilibre du K R= constante des gaz parfait T= température absolue Z= valence de l’ion F= Constante de Faraday

20. Le gradient électrochimique et la conductance Dans la réalité les membranes cellulaires sont perméables à plusieurs ions. Elles sont couvertes de canaux différents qui peuvent être ouvert quand la membrane est au repos Ceci implique un flux d’ions au repos Si on enregistre la membrane d’une cellule au repos, selon le type de cellule le potentiel de repos sera compris entre -40 et -60 mV Ce qui signifie que le potentiel de repos ne correspond à aucun potentiel d’équilibre pour les ions. On aura donc un gradient électrochimique tel que On en déduira le flux d’ionslié au gradient électrochimique Pour leK+ -60-(-85) = +25 Par convention, le signe + signifie que l’ion quitte la cellule. C’est donc un flux sortant. Pour le Na -60-(+58) = -118 l’ion entre dans la cellule, C’est donc un flux entrant

21. Notion de gradient électrochimique Ext Int [K+]=140 [K+]=5 Force selon le gradient de concentration - - - - - - - - ++++ ++++ Force selon le gradient électrique Flux net d’ions K+

22. Notion de gradient électrochimique Ext Int Ext Int [Na+]= 140 [Na+] =14 [K+]=140 [K+]=5 Force selon le gradient de concentration - - - - - - - - - - - - - - - - ++++ ++++ ++++ ++++ Force selon le gradient électrique Flux net d’ions Na+ K+

23. Notion de gradient électrochimique Ext Int Ext Int [Na+]= 140 [Na+] =14 [K+]=140 [K+]=5 Force selon le gradient de concentration - - - - - - - - - - - - - - - - ++++ ++++ ++++ ++++ Force selon le gradient électrique Flux net d’ions Ca2+ Cl-

24. Notion de conductance Le flux d’ion ne dépend pas seulement du gradient électrochimique mais aussi de la conductance

25. Rappel Notion de conductance C’est l’inverse de la résistance Notion de tension Une tension est mesurée entre 2 points d’un circuit et correspond à une différence de potentiel entre les deux bornes tension aux bornes de AB les potentiels aux bornes de A et de B Notion d’additivité des tensions Les tensions s’additionnent (Loi de Charles) voir Notion de masse Les potentiels peuvent être mesurés entre une borne A et la masse, souvent la terre

26. Rappel Notion de conductance On a vu que la conductance était l’inverse de la résistance. C’est donc la facilité avec laquelle le courant se déplace ou encore la facilité avec laquelle les ions vont traverser la membrane Unité SI en Siemens = conductance d’un canal = résistance d’un canal La conductance de la membrane pour un ion est La conductance de la membrane est donc proportionnelle à: La conductance d’un canal pour un ion Le nombre de cet ion La probabilité d’ouverture de ces canaux

27. Mesure de courant électrique ou loi d’Ohm appliquée à un gradient électrochimique La loi d’Ohm Ou iion est l’intensité du courant traversant un canal ionique ou courant élémentaire Et pour une cellule entière comportant plusieurs canaux le courant transmembranaire pour un ion avec plusieurs canaux s’écrit

28. Représentation schématique d’un canal ionique et d’une membrane sous forme d’un circuit électrique int Le canal à une résistance V V La membrane a une capacité ext Le gradient de concentration peut être assimilé à une pile avec une force électromotrice égale au potentiel d’équilibre Pour le K+ avec un courant de 1pA

29. Rappel Cas d’une membrane avec plusieurs canaux Dans un premier temps considérons une membrane perméable au Na+ et au K+. Le potentiel d’équilibre sera atteint quand le flux des charges + sera nul Ou encore quand

30. Au repos le potentiel de membrane ne sera égal à aucun potentiel d’équilibre d’un canal K+ ou Na+ C’est-à-dire ni -84, ni+58 mais quelque chose d’intermédiaire Si deux canaux Si n canaux Ext Int Pompe N+K+ et Ca++ Transport actif

31. Le flux d’ion à travers une membrane cellulaire est donc le résultat du produit du gradient électrochimique par la conductance

32. Gradient Concentration Électrique Gradient Electrochimique Conductance X = Na+ Na+ Ext Int +++ - - - X X X x = = = = + K+ K+ Ext Int +++ - - - +++ Cl- Cl- Ext Int +++ - - - 0 0 Ca2+ Ca2+ Ext Int +++ - - - 0 Pour Vm=-60mV

33. Notion de Variation du potentiel de membrane Lorsque le potentiel de membrane se déplace vers des valeurs plus négative on dit que la cellule s’hyperpolarise Lorsque le potentiel de membrane se déplace vers des valeurs plus positive on dit que la cellule se dépolarise +58 0 -60 -84 Dépolarisation Potentiel de repos Hyperpolarisation t

34. Notion de variation de potentiel +58 0 -60 -84 Dépolarisation Potentiel de repos Hyperpolarisation t Dépend de l’ouverture des canaux Du nombre et de la probabilité d’ouverture des canaux Et de la concentration ionique de part et d’autre de la membrane

35. Les courants transmembranaires 2 types d’expériences 1- On modifie le potentiel de membrane : Courant imposé 2- On modifie le nombre de canaux ouverts Modification du Potentiel de membrane. Le cas de la dépolarisation. V 1 Pipette d’enregistrement 2 1: on injecte le courant 2: libération de K+ 3: Accumulation de charges Augmentation de Cm Courant capacitif 4: Les charges traversent Courant de fuite 3 4

36. - + + - 0 +10 -60 4 4 - + 1 V 3 2 -50 Equivalent électrique 3: La charge de la capacité ouvre le circuit et fait passer Vm de -60 à -50 mV du fait de la conductance membranaire (10-8S) Ce courant charge rapidement le condensateurpuis décroissance progressive Si on maintient le courant (100pA) Au niveau du potentiel de membrane V’m=-50 Vm=-60

37. 0 +10 -60 - + + - 4 4 - + 1 V 3 2 -50 Equivalent électrique Puis V-EK passe à V’-EK Comme IK=gK(V-EK) Si V-Ek augmente alors Ik augmente L’états stationnaire est atteint quand Ik dans la membrane est égale au courant imposé alors V’ sera dans un état stationnaire

38. - + + - 0 +10 -60 4 4 - + 1 V 3 2 -50 Equivalent électrique im ic Capacité et résistance sont placés en parallèle Donci=ic+im i Dans un premier temps la capacité se charge Une fois chargé le courant passera progressivement par le canal Ic + Im = i V’m=-50 Vm=-60 63%

40. Méthode du potentiel imposé On impose un voltage On maintient le voltage (générateur extrêmement réactif) + - Potentiel imposé Vm On injecte un courant et on le maintient quelque soit les échanges au travers de la membrane et on mesure Im le courant transmembranaire dans une condition stable de potentiel imposé donc connu Im

41. T1 T2 0 mV Vm Ic IF Im -50 -60 T1: On maintient Vm à -50mV Pas de canaux Na voltage dépendant ouvert L’ampli doit délivrer un courant continu = au courant porté par les ions au travers de la membrane Ce courant = If ou courant de fuite En effet, L’accumulation de charges positives sous la membrane va charger la capacité membranaire ce qui induit un courant IC sortant Ce courant Ic est observé à l’instauration du stimulus T2: Dès que dV ne varie plus Ic=0 La somme des 2 courants Ic + IF = IM Quand Ic= 0 alors Im=If C’est-à-dire le courant de fuite appliqué par l’expérimentateur est alors égale au courant transmembranaire Sortant Entrant

42. T1 T2 0 mV Vm Ic IF INa Im -50 -60 T1: On passe à 0mV les canaux Na Voltage dépendant s’ouvre et Na va entrer dans la cellule ce qui crée un courant positif entrant. L’ampli doit alors enlever immédiatement des charges positives correspondant au Na+ qui est entré pour maintenir le potentiel sinon autres phénomènes de régénération et Vm varie. T2: On a donc Im=Ic+If+Ina On mesure Im quand Ic=0 If ayant été mesuré au départ on a donc Ina on peut ainsi mesurer La probabilité d’ouverture des canaux Leur duré d’ouverture (indépendant du potentiel) Leur caractéristique de fermeture ou d’innactivation (automatique pour Na) Sortant Entrant

43. + - Potentiel imposé -50 mV Vm + - Potentiel imposé 0mV Vm ++++ Courant capacitif + courant de fuite = courant sortant (faible) +Ouverture des canaux Na voltage dépendant Entrant (élevé) Au total Courant entrant élevé Im Courant capacitif + courant de fuite = courant sortant ++++ Im

44. Experience en potentiel imposé Exemple du canal Na En A on impose répétitivement des sauts de potentiels d’amplitude croissante On obtient les courbes A1 ou l’on remarque un courant entrant de Na (ouverture de canaux Na voltage dépendant). On remarque que ce canal s’inactive alors que le potentiel est maintenu En A2 la perfusion de pronase bloque l’inactivation du canal sodium qui reste ouvert

45. * * * Exemple d’expérience en potentiel imposé Exemple du canal Na En B on construit la courbe Ina en fonction de V à partir du pic de la réponse pour chaque valeur de V (*) E Na=+58mV Interprétation: le courant entrant augmente jusqu’à -20 mV puis décroît progressivement pour changer de sens au-delà de + 50 mV proche de ENa La conductance élémentaire reste constante En dessous de -50mV canaux fermés, au delà de +40 mV canaux ouverts

46. Application au potentiel d’action