Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica

1. Técnicas de Biologia Molecular em Microbiologia Clínica TÉCNICAS DE AMPLIFICAÇÃO DE ÁCIDOS NUCLEICOS Prof.Doutor José Cabeda

2. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

3. PCR

5. OPTIMIZAÇÃO DO PCR • [MgCl2] • Th • [dNTP] • [primers] • [DNA] • [inibidores]

6. RT-PCR RT PCR RNA cDNA prod. ampl. Nested PCR 1º PCR 2º PCR Variantes do PCR

7. Nested - PCR

8. PCR Multiplex

9. RT-PCR Multiplex PCR Nested PCR Assymetric PCR Degenerate PCR Hot Start PCR In Situ PCR Long-PCR PCR-ELISA PCR-RFLP PCR-SSCP RAPD-PCR REP-PCR Touchdown PCR Variantes do PCR

10. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

11. Principio de funcionamento do Real-Time PCR Prof.Doutor José Cabeda

12. Detecção dos produtos de PCR

13. Montar uma reacção

14. Químicas Utilizáveis Prof.Doutor José Cabeda

15. 3’ 5’ SG SG SG SG SG Excitation 3’ 5’ SYBR-Green I

16. 3’ 5’ SG SG SG SG SG Excitation Emission 3’ 5’ SYBR-Green I

17. Detcção com SybGreen

18. Sybr-Green Detection • Intercalates to dsDNA • Inhibits DNA amplification so concentration is critical • Detects specific and non-specific targets • Low starting background with large increase in signal • Can run a melt curve to look at product specificity

19. Detecção com sondas

20. Quimicas utilizáveis:sondas taqman

21. 3’ 5’ R Q Q R Excitation Excitation R Q R Q 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ Sequence specific probes: Dual labeled probes

22. Quimicas utilizáveis:molecular beacons

23. DabCyl FAM 10mer 25mer Molecular Beacons I

24. Excitation R Q Q Emission R Q R Molecular Beacons II X

25. Molecular Beacons III • Can be used to quantitation and mutation detection • Need beacons for the normal and mutation sequence • Design is difficult due to nature of folding structure • Expensive when compared to FRET

26. Quimicas utilizáveis:sondas FRET

27. Transfer Excitation Emission Hyb-ProbesTM Oligo 1: Fluorescein Oligo 2: Quencher Prof.Doutor José Cabeda

28. 5’ 3’ Quenched FRET analysis • Two labeled probes, FAM at the 5’ and BH1 on the 3’ • When the probes hybridize the FAM energy is quenched by the BH1 • After the product is amplified run a melt curve to determine genotype • Different melt points are seen for normal and mutation

29. MGB MGB F F F F F Q Q Q Q Quimicas utilizáveis:sondas Eclipse

30. Aplicações Quantificação Prof.Doutor José Cabeda

31. End Point versus Real-Time

32. Quantificação

33. Aplicações Detecção de Mutações / SNP Prof.Doutor José Cabeda

34. Detecção de mutações

35. Aplicações Multiplex Detection Prof.Doutor José Cabeda

36. Detecção simultânea de vários produtos

37. Os equipamentos Prof.Doutor José Cabeda

39. LightCycler

40. SmartCycler

41. Rotorgene • The samples spin continually during a run at 500 rpm • The samples are heated and cooled in a low mass air oven • Tubes are illuminated as they pass the detector • On data acquisition energy is averaged over 20 revolutions to give the fluorescence of each sample • Four Channels • Ch1: ex 470nm, det 510nm • Ch2: ex 530nm, det 550nm • Ch3: ex 585nm, det 610nm • Ch4: ex 625nm, det 660nm

42. Near Patient TestingLaboratório de Urgência

43. Técnicas de amplificação de ácidos nucleicos • PCR • Real Time PCR • NASBA/TMA

44. NASBA/NUCLISENS

45. Amplification: schematic diagram Primer 1 Legend: Reverse Transcriptase • sense RNA • antisense RNA • sense DNA • antisense DNA RNase H Primer 2 Reverse Transcriptase T7 RNA polymerase Primer 2 Reverse Transcriptase Reverse Transcriptase RNase H Primer 1

46. Técnicas de amplificação de Sinal • bDNA (Quantiplex)

47. bDNA (I)

48. bDNA (II)

49. bDNA (III)

50. bDNA (IV)