D é tection optique de biomol é cules uniques

1. Détection optique de biomolécules uniques Maxime Dahan Laboratoire Kastler Brossel Département de physique Ecole normale supérieure

2. Mesure de l’activité enzymatique

3. Mesure optique de l’activité d’une cholestérol oxydase oxydé réduit (compatible avec une réaction en deux étapes) Lu et al., Science (1998)

4. Résolution/Localisation

5. Résolution spatiale vs Localisation localisation spatiale : déterminée par la précision de pointé du centre de la PSF (réponse impulsionnelle du système optique)

6. Résolution spatiale Pour un bon objectif: NA = 1.4, R = 250 nm

7. PSF expérimentale Taille pixel : 216 nm Yildiz et al., taille du pixel: 86 nm

8. Fonction d’Airy Gaussienne Réponse impulsionnelle Une molécule unique peut être considérée comme une source ponctuelle pour le système optique. La réponse impulsionnelle (la PSF, point spread function) est une fonction d’Airy, souvent approximée par une courbe gaussienne 2D. Rayon d’Airy (premier zéro) : Gaussienne 2D : où NA = 1.45, l = 600 nm

9. Localisation La précision du pointé dépend de la capacité à déterminer la position du pic • De manière générale, la précision s dépend de : • nombre de photons collecté N • taille a des pixels • niveau de bruit b Dans le cas d’un signal dominé par le bruit de photons:

10. Explication qualitative On imagine que le point d’arrivée Xi de chaque photon peut être localisé sur le détecteur avec une précision infinie (pixel infiniment petit). On collecte N photons dont la distribution des positions (Xi) correspond à la PSF (de position moyenne m et de largeur s). On a un estimateur de la position moyenne.

11. Mouvement d’un moteur moléculaire : la myosin V Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization: A. Yildiz et al., Science 300, 2061-2065 (2003 ).

12. CY3 Déplacement de la myosin

13. Mouvement de la kinésine Yildiz, Science (2004)

14. Peut-on gagner en résolution ? • si il existe un moyen de distinguer les deux objets : spectre d’émission, durée de vie, polarisation,… Lacoste, PNAS (2000) • Si deux fluorophores identiques: photobleaching Gordon et al., PNAS (2004)

15. PhotoActivated Localization Microscopy (PALM) Photoactivation of a few PA-GFP tagged molecules with a blue laser at 405 nm Detection, localization (with nm resolution) and photobleaching with a laser at 488 nm

16. Current limitations: long aquisition time (hours) no z resolution

17. Les « motility assays »myosine/actinekinésine/microtubulesProtéines/ADN

18. Interactions ADN-Protéines: visualisation optique en molécules uniques Mesurer des interactions qui ne se traduisent pas par un changement de longueur de l’ADN Ex: mécanisme de reconnaissance des sites d’activité (polymérase, endonuclease,…) Etudier des propriétés qui dépendent de la séquence

19. Location of target sites by DNA-binding proteins: a long-standing biological question Site-specific proteins must locate short targets on long DNA molecules. The location can be much faster than predicted by 3D diffusion. Ex: Lac repressor (Riggs 1970): experiments kA>1010 M.s-1 (kA~108 M.s-1 expected) Proposed mechanisms involve interactions with non-target DNA: sliding: correlated motion along DNA hopping: small jumps between non-adjacent sites jumping :jumps between distant DNA sites

20. Stretching DNA Transverse fluctuations of a DNA molecule Exposure time: 20 ms. Wide field: stretched DNA molecules Exposure time: 200 ms. A. Crut et al.,Phys. Rev. E 67, 051910 (2003)

21. Experimental results Interaction between EcoRV and DNA: (a) T7 DNA/SybrGreen (b) Qdot-EcoRV qdot 605 nm Exposure time: 20 ms Analysis of the trajectories: (b) (a) 2D Gaussian fit:center of the PSF (10-20 nm) Transverse motion: DNA thermal fluctuations Longitudinal motion: DNA fluctuations + diffusion ?

22. Analyse des trajectoires :la fonction de déplacement quadratique moyen Moyenne des déplacements quadratiques pendant Dt

23. Analyse des trajectoires :la fonction de déplacement quadratique moyen Moyenne des déplacements quadratiques pendant 2Dt

24. Analyse des trajectoires :la fonction de déplacement quadratique moyen Moyenne des déplacements quadratiques pendant 3Dt

25. Analyse des trajectoires :la fonction de déplacement quadratique moyen

26. Analysis of the transverse motion Trajectory : DNA thermal fluctuations + motion of the enzyme To extract the 1D-diffusion : Mean Square Displacement Transverse motion : <(x(t+)-x(t))2> = 2sx2 (1-e-  / f )  2 sx2 (Desbiolles et al., unpublished)

27. Analysis of the longitudinal motion Longitudinal motion: <(y(t+)-y(t))2> = 2 sy2 + 2D  Diffusion coefficient : D 2 10-3mm2.s-1  (200 bp)2.s-1 (24 events) (qdot-EcoRV D3 10 mm2.s-1)

28. Mesure en polarisation : étude de la dynamique rotationnelle de F1-ATPase

29. L’émission d’un dipole linéaire est polarisée Permet de réperer l’orientation du fluorophore Récemment : développement de colorant bifonctionnel

30. Relation entre changement de conformation et fonction: approche par transfert d’énergie

31. ~ 1 ps distance R molécule donneuse molécule acceptrice Transfert d’énergie ~ 1 ps laser

32. Couplage dipole-dipole Si r << l, seulement le champ proche: Terme de couplage:

33. Transfert d’énergie Taux de transfert kT : R0 : rayon de Forster, en général de l’ordre de 5 nm tD: durée de vie de l’état excité du donneur en absence d’accepteur Efficacité du transfert : Mesure de distance à l’échelle: 0.5 R0 à 1.5 R0, soit entre 2.5 à 7.5 nm (comparable à la taille d’une protéine)

34. Rayon de Forster

35. en présence d’accepteur en l’absence d’accepteur Comment mesurer E ? • mesure des intensités émises par le donneur et l’accepteur : • mesure de la durée de vie du donneur :

36. Un vernier spectroscopique Deniz et al. PNAS (1999)

37. Etude de conformation de biomolécules Relier la dynamique des changements conformationels à la fonction: Ex: nuclease

38. Applications à l’étude du repliement des protéines Paradoxe de Lévinthal: on considère une chaine peptidique de 100 a.a. et on fait l’hypothèse qu’il y a trois conformations possibles par a.a. et que chaque conformation est explorée pendant 10-14 s Trep~ 1026 années !! Idée: Il existe des états intermédiaires qui sont de durées de vie brèves et sont difficilement accessibles par des mesures d’ensemble.

39. cold-shock protein from the hyperthermophilic bacterium Thermotoga maritima Bon système à deux états Schuler et al., Nature (2002) Mesure à l’équilibre : permet néanmoins de mettre une borne sur la barrière de potentiel.

40. 10 µm L Cinétique de repliement dans un mixeur microfluidique La temps de mélange tm est déterminé par la diffusion transverse wf2/D dans le canal. L’évolution temporelle se lit selon la distance dans le canal. tm ~ 10 µs T = L/v Si v est très grand : pas le temps de faire des mesures sur molécules uniques Knight et al., PRL (1998)

41. Cinétique de repliement dans un mixeur microfluidique (2) Lipman et al., Science (2003)

42. Visualisation de molécules uniques en cellules vivantes

43. Single molecule imaging Cells as interaction networks a complex network of biochemical interactions: Kholodenko, Nat. Rev. Mol. Cell. Bio (2006) organized in time and in space

45. compartimentalisation membranaire

46. The fluid-mosaic model Singer and Nicolson (1972) « fast » proteins diffuse with D ~ 0.1 µm²/s (movie from A. Kusumi’s lab)

47. Des molécules uniques comme des sondes de la membrane à l’échelle nanométrique

48. Tracking membrane proteins • for d < 1 µm, diffusion is not affected by the probe with • diffusion in a 2D medium

49. Deux problèmes avec le modèle de mosaïque fluide 1. Diffusion dans la membrane plasmique est plus lente que dans une membrane modèle d’un facteur 5 à 50 • diffusion d’un lipide dans une membrane modèle: D ~ 1 µm²/s • diffusion d’un lipide dans la membrane plasmique: D ~ 0.1 µm²/s 2. Lors d’une oligomérization, la diffusion est considérablement ralentie

50. Modèle d’organisation en microdomaine Murase et al. Biophys. J. (2004)