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Analytische Charakterisierung der traditionellen chinesischen Medizin (TCM)

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Analytische Charakterisierung der traditionellen chinesischen Medizin (TCM)

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  1. AnalytischeCharakterisierungdertraditionellenchinesischenMedizin (TCM) Seminar 2 30.05.2012 Benjamin Hanf

  2. Geschichte -13 Jhd. v. Chr. -8 bis -1 Jhd. v. Chr. heute Geister / Magie Entsprechungsmedizin Reaktion des Ernährung mit Kraut namens ImmunsystemsKu-Jung Verhütungsschutz Verbreitung

  3. TCM ist: • Physiotherapie • Akupunktur / Moxibustion (Akupunktur mit Erwärmung der Punkte) • Massagetechniken (TuinaAmno, Shiatsu) • Bewegungsübungen (Quigong, Taijiquan) • Arzneimitteltherapie Arzneitherapie: Wie in der Medizin, die wir kennen Weitere Bestimmung: - Kombinierbarkeit und Unverträglichkeit mit anderen Drogen - Toxizität und die Dosierung entsprechend der Verabreichungsform

  4. Meinungen über TCM • Wieso ist das Misstrauen gegen TCM so hoch? • Akupunktur-Studie: • Korrekten Einstich-Punkte vorsätzlich missachtet, dennoch selben „heilenden“ Effekte berichtet • Vergiftungsfälle (Aristolochiasäuren; die genotoxisch, kanzerogen, nierenschädigend) • In hohen Konzentrationen in manchen Pflanzenwurzeln vorhanden (bis 10%) • positiver Effekt: Schlankheitsmittel, regen laut TCM Blutfluss an • Gemisch aus vielen verschiedenen Wirk- und Hilfsstoffen • Tierprodukte + Pflanzen, Rezepte online verfügbar (tcmassistant.com) http://www.pharmazeutische-zeitung.de/index.php?id=pharm1_37_2004

  5. Arten- und Tierschutz Gefährdete Tierarten (in TCM verwendet) Tiger Zerstörung des Lebensraums Schneeleopard Asiatischer Schwarzbär Bärenfarmen Nashorn Chin. Viagra: Nashorn-Hornmehl Saiga-Antilope (1990 vom WWF: Substitut für Nashorn) Sägerochen Seepferdchen Schildkröten gering gefährdet vom Aussterbe bedroht

  6. Mixturen mit tausend möglichen Wirkstoffen http://de.wikipedia.org/wiki/Traditionelle_chinesische_Medizin

  7. Screening für unbekannte Wirkstoffe mit Hilfe von HSA (human serum albumin) LongdanXieganDecoction (LXD) Gelbsucht, Blasen- und weitere Entzündungen Chromatogramm mit HSA-Säule (RP-HPLC); Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD Wechselwirkung mit menschlichem Blut HPLC

  8. Screening LXD 2D Chromatographie ODS Octadeca-(C18-) Säule ACN Acetonitril ODS, Gradient: 1% ACN – 60% ACN in 5Min 5 Min ODS, Gradient: 1% ACN – 90% ACN in 65Min 50 Min Trennung einzelner Peaks (RP-HPLC); Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD

  9. Screening LXD 2D Chromatographie mV t in Min. 2D-Analyse; Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD Analyse der einzelnen Fraktionen  Separation von 100 Komponenten (19) Einzelne Ergebnisse

  10. Detektion mittels MS Detektion von Tanshinonen in „Dan-Shen“ Wirkt gegen hämatologische Abnormalitäten und Cardiovascular-Erkrankungen Detektion: ESI-MS • Ziel: • Medikamentenentwicklung • Qualitätskontrolle MS

  11. Detektion mittels MS

  12. Detektion MS Ergebnistabelle Min Yang et al., 2006 „Characterization of tanshinones in the roots of Salvia miltiorrhiza (Dan-shen) by high-performance liquid chromatography with electrospray ionization tandem massspectrometry“

  13. Detektion MS Ergebnistabelle

  14. Detektion MS Ergebnistabelle • 35 Tanshinone • 27 charakterisiert • 9 eindeutig nachgewiesen werden (Referenzstandards; Retentionszeiten) • Strukturen unbekannter Peaks konnten anhand der MS aufgezeigt werden • 5 neue Verbindungen

  15. Detektion MS Beispiel Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“

  16. Detektion MS Beispiel Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“ Bsp. unbekannte Substanz

  17. Extraktion • Wie kann man die aktiven Komponenten aus den TCM-Mixturen gewinnen • SFE: Supercritical Fluid Extraction • PLE: Pressurised Liquid Extraction • MAE: Microwave-assisted Extraction • UAE: Ultrasonic-assisted Extraction • MISPE: molecularly imprinted polymer solid phase extraction

  18. UAE Ultrasonic-assisted Extraction Vgl. : Ultraschallbad, Kavitationseffekt Abbildungen Masters Thesis Lindau; Lindau, Olgert „Dynamik und Lumineszenz lasererzeugter Kavitationsblasen (1998) DPI Schallwellen: Druckabfall Blasenbildung in LM Druckanstieg  Blasen implodieren resultierende Flüssigkeitsstrahlen auf Feststoff  Scherkräfte • niedrige Temperaturen • gesteigerter Massentransfer durch mechanische Effekte Bsp.: Rutin aus Euonymus alatus (TCM: Antimikrobiell, Blutdrucksenkend)

  19. Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin: • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber MISPE molecularly imprinted polymer solid phase extraction

  20. Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber N2-Begasung, 60°C Acrylamid Template THF EGDMA und AIBN Stoffe

  21. Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber Rutin Strukturformel Acrylamid Template THF EGDMA und AIBN

  22. Funktionsweise MIPs Probe + MIPs Waschschritt Elution des Analyten Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Schematisches Diagramm der MIPSE Prozedur“

  23. Nachweis via HPLC Chromatogramm Standards Lösung vor MISPE Lösung MIPs nach Wachschritt Elution des Analyten Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Schematisches Diagramm der MIPSE Prozedur“

  24. Test mit verschiedenen anderen TCMs Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Chromatogramme behandelter TCM-Proben“

  25. Test mit verschiedenen anderen TCMs Ausbeute Ausbeute in %: 93,43 90,11 92,31 90,01 Modifiziert nach Lin Peng et al., 2010 „Tabelle über Effizienz der MIPSE Prozedur“

  26. Nachweis der Wirksamkeit Modifiziert nach Li Liu et al., 2011 „Effekte auf Viskosität bei versch. Scherraten“ • - Asp gleich mit HSYA, Amy bei hohen Scherraten • - Bei niedrigen Scherraten Asp gleich mit TH oder Amy + HSYA • Wirkende Hauptkomponenten in TH: Amy + HSYA (aktiviert Blutfluss, löst • Blutstauung auf) Amy + HSYA

  27. Zusammenfassung TCM: - TCM und deren Wirkung - Nashorn-Hornmehl, Akkupunktur - Bärengalle (synthetisch Herstellbar), TH - Extraktionsmethoden sehr vielfältig - Optimierung: MIPs, HSA + Chromatographie - Detektion (MS, HPLC) - Identifizierung nicht immer eindeutig und komplett - Aktivität / Funktion testen (TH) - Optimierung: Entwicklung biologischer Modelle Potentiell interessante Wirkstoffe aus TCM in westliche Medizin integrieren

  28. Bärenfarm http://www.geo.de/GEO/natur/tierwelt/3613.html?p=2 China, Korea, >14.000 Tiere Überangebot Kosmetika und anderen Luxusprodukten Chin. Medikamentenbeschreibung

  29. Referenzen - Hongda Ma et al., “Simultaneous determination of tetrahydropalmatine, protopine, and palmatine in rat plasma by LC-ESI-MS and its application to a pharmacokinetic study”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2009 - Zong-De Zhai et al., „Chiral high-performance liquid chromatographic separation of the enantiomers of tetrahydropalmatine and tetrahydroberberine, isolated from Corydalis yanhusuo”, Anal Bioanal Chem (2006) 384: 939–945 - Junjie Ou et al., „Determination of dl-tetrahydropalmatine in Corydalis yanhusuo by l-tetrahydropalmatine imprinted monolithic column coupling with reversed-phase high performance liquid chromatography”, Journal of Chromatography A, 1117 (2006) 163–169 - Lingling Ren et al., „High performance liquid chromatography-mass spectrometry analysis of protoberberine alkaloids in medicine herbs”, J. Sep. Sci. 2007, 30, 833 – 842 - Weidong Daia et al., „Effect of the traditional Chinese medicine tongxinluo on endothelial dysfunction rats studied by using urinary metabonomics based on liquid chromatography–mass spectrometry”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 56 (2011) 86– 92

  30. - Tao Yi et al., „Comparison of the chemical profiles and anti-platelet aggregation effects of two“Dragon’s Blood” drugs used in traditional Chinese medicine”, Journal of Ethnopharmacology 133 (2011) 796–802 - Lin Peng et al., „Molecularly imprinted polymer for solid-phase extraction of rutin in complicated traditional Chinese medicines”, Analyst Accepted 10th November 2010 - Lin Peng et al., “Taoren–Honghua herb pair and its main components promoting blood circulation through influencing on hemorheology, plasma coagulation and platelet aggregation”, Journal of Ethnopharmacology (2011) - Wei Zhou et al., „Characterization of the Active Constituents in Shixiao San Using Bioactivity Evaluation Followed by UPLC-QTOF and Markerlynx Analysis”, Molecules 2010, 15, 6217-6230; doi:10.3390/molecules15096217 - Qing-Ce Zang et al., „Searching for the main anti-bacterial components in artificial Calculus bovis using UPLC and microcalorimetry coupled with multi-linear regression analysis”, J. Sep. Sci. 2011, 34, 3330–3338

  31. - Jing Zhanga et al., „Systematic screening and characterization of tertiary and quaternary alkaloidsfrom corydalis yanhusuo W.T. Wang using ultra-performance liquid chromatography–quadrupole-time-of-flight mass spectrometry”, Talanta 78 (2009) 513–522 - Jing-Bo Penga et al., “Qualitative and quantitative characterization of chemical constituents in Xin-Ke-Shu preparations by liquid chromatography coupled with a LTQ Orbitrap mass spectrometer”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 55 (2011) 984–995 - Bo Ding et al., “Qualitative and quantitative determination of ten alkaloids in traditional Chinese medicine Corydalis yanhusuo W.T. Wang by LC–MS/MS and LC–DAD”. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 45 (2007) 219–226 - B.Y. Ge et al., “Identification of amygdalin and its major metabolites in rat urine by LC–MS/MS”, Journal of Chromatography B, 857 (2007) 281–286 - GUAN Tian-Ye et al., “Recent Development in Liquid Chromatography/Mass Spectrometry and Allied Topics for Traditional Chinese Medicine Research”, Chinese Journal of Natural Medicines 2011, 9(5): 0385−0400 doi: 10.3724/SP.J.1009.2011.00385

  32. - Bo Ding et al., „Qualitative and quantitative determination of ten alkaloids in traditional Chinese medicine Corydalis yanhusuoW.T. Wang by LC–MS/MS and LC–DAD”, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 45 (2007) 219–226 • - Chen-Wen Chiu et al., „Analyses of alkaloids in different products by NACE-MS”, Electrophoresis 2007, 28, 4220–4226 • - YaserBitar et al., „Enantioseparation of chiraltropa alkaloids by means of cyclodextrin-modified microemulsionelectrokinetic chromatography”, Electrophoresis 2007, 28, 2693–2700 • Tao Yi et al., “Comparison of the chemical profiles and anti-platelet aggregation effects of two“Dragon’s Blood” drugs used in traditional Chinese medicine”, Journal of Ethnopharmacology 133 (2011) 796–802 • Kaufmann et al., „Recent Extraction Techniques for Natural Products: Microwave-assistedExtractionandPressurised Solvent Extraction“ (2002) in: Phytochem. Anal. 13, 105–113

  33. - Peng, J et al., „Efficient new method for extraction and isolation of three flavonoids from PatriniavillosaJuss. by supercritical fluid extraction and high-speed counter-currentchromatography“(2006) in: Journal of Chromatography A, 1102, 44–50 • Prasad, N. et al. „Effects of high-pressure treatment on the extraction yield, phenolic and antioxidant activity of litchi (Litchi chinensisSonn.) fruitpericarp“(2009) in: International Journal of Food Science and Technology 2009, 44, 960–966 • - Wang, J., et al., „Microwave-assisted extraction of flavonoids from Chinese herb Radix puerariae (Ge Gen)“ (2010), in:Journal of Medicinal Plants Research, Vol. 4(4) pp. 304-308 • Yang, et al.,“Ultrasound-assisted extraction of rutin and quercetin from Euonymusalatus (Thunb.) Sieb“(2008) in UltrasonicsSonochemistry 15, 308–313 • Yun Wang et al., „Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LongdanXiegan Decoction by on/off-line comprehensivetwo-dimensional biochromatography“Journal of Chromatography B, 860 (2007) 185–194

  34. Vielen Dank für Ihre Aufmerksamkeit Haben Sie Fragen?

  35. Bärenfarm • „beseitigt Hitze in der Leber“ • „schafft Erleichterung bei Krämpfen und krampfartigen Anfällen“ • „verbessert die Sehschärfe“ • „entfernt Hitze und giftige Stoffe“ Auflösung von kleinen Gallensteinen und zur Behandlung einer Reihe von Lebererkrankungen zurück

  36. Wirkt TCM wirklich? Vorteil dieser Studie: Einfache Komposition aus nur zwei verschiedenen Einheiten in der TCM (normalerweise deutlich mehr) Taoren–Honghua (TH) soll Blutzirkulation anregen Wirkende Substanz (Hauptkomponenten in TH): Amygdalin (ca. 1,696% in TH) und Hydroxysafflor yellow A (HSYA, ca. 0,909% in TH) Amygdalin spaltet in Gegenwart von Wasser Blausäure ab Vergleich zu Aspirin als Blutverdünnungsmittel; „Aspirin-Resistenz“

  37. Arbeitsweise: • - Kräuter ernten (identifizieren, Reinheitsgrad bestimmen, dieser liegt hier bei 95-98%) • - Extraktion (Aufschluss, Lösen der Substanzen, Filtration) • - Mischen der beiden Extrakte, Aufkonzentrierung (vacuum concentration) • Trennen der Komponenten via RP-HPLC (stat. Phase: GRACE-Apollo-C18 (150*4,6 mm) mit Gradient von 15% -38% MeOH (30 Min)-54%(60 Min) • UV-Detektor: 210, 310, 405 nm (Abs. 200 nm-410 nm) • Substanz dem Testorganismus verabreichen • Blutfluss zum Stillstand bringen (Adrenalin injizieren + Testorganismus in eiskaltes Wasser aussetzen, alle außer Kontroll-Gruppe) • Blut untersuchen (Viskosität: WBV)

  38. Nachweis der Hauptsubstanzen Standard Probe mit TH

  39. - Asp gleich mit HSYA, Amy bei hohen Scherraten • - Bei niedrigen Scherraten Asp gleich mit TH oder Amy + HSYA • Wirkende Hauptkomponenten in TH: Amy + HSYA (aktiviert Blutfluss, löst • Blutstauung auf) zurück

  40. hohes Lösemittelvermögen SFE Supercritical Fluid Extraction niedrige Viskosität Abbildung: Modifiziert nach SupercriticalCO2 (Quelle: Sticher, (2008)) • - Kurze Extraktionszeiten • Umweltschonend (CO2: Tk 31°C, pk 73,8 bar) • geringe Kosten, milde Bedingungen (T>Tk, p>pk) Bsp.: Koffein aus Kaffepulver zurück

  41. PLE Pressurised Liquid Extraction Erhöhter Druck: 10-15 mPA, erhöhte Temperatur: 50°C - 200°C Abbildung: Komponenten PLE-Systems (Quelle: Sticher, (2008)) • Sehr kurze Extraktionszeiten • selektiv durch Einstellen der Temperatur, LM • sehr Effizient Bsp.: Anthocyane aus roten Trauben (bei koronaren Herzerkrankungen) zurück

  42. MAE Microwave-assisted Extraction Erhöhter Druck: 300 kPA, >250 W, polares Lösemittel Abbildungen: Komponenten PMAE und FMAE Systems (Quelle: Sticher, (2008)) • Sehr kurze Extraktionszeiten • selektiv durch Einstellen von: W, LM • sehr Effizient Bsp.: Flavonoide aus Ge Gen (TCM: Kopfschmerzen, Bluthochdruck) zurück

  43. Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber Template THF

  44. Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber Acrylamid Template THF

  45. Extraktion Beispiel: • Rutin, 3,3‘,4‘,5,7-pentahydroxyflavone-3-(O-rhamnosylglucoside) • Wirkung Rutin : • - Blutdrucksenkend • antimikrobielle Wirkung • positive Wirkung auf Herz und Leber EGDMA (ethyleneglycoldimethacrylate) und AIBN Acrylamid Template THF zurück

  46. Screening LXD Online-Analyse mittels MS Identifizierung von 19 Komponenten anhand Retentionszeit, UV Spektrum, Molekulargewicht, MS Links UV Spektrum, rechts MS Spektrum Yun Wang et al., 2007: Biological fingerprinting analysis of the traditional Chinese prescription LXD Komponenten müssen auf Wirkung getestet werden (einzige Komponente / mehrere gleichzeitig wirksam?) zurück

  47. Detektion MS Beispiel unbekannte Substanz m/z 275 ([M+H–18]þ), 247([M+H–18–28]þ), 219 ([M+H–18–56]þ) 204 ([M+H–18–56–15]þ) Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“ MS

  48. Detektion MS Beispiel unbekannte Substanz m/z 275 ([M+H–18]þ), 247([M+H–18–28]þ), 219 ([M+H–18–56]þ) 204 ([M+H–18–56–15]þ) Ähnlich zu Tanshinone IIA Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“

  49. Detektion MS Beispiel unbekannte Substanz Tanshinone IIA Didehydrotanshinones IIA DB 15-16 DB 15-16 DB 2- 3 Rt 28,16 Rt 28,6 um 2 Th Unterschied zu Tanshinone IIA  Didehydrotanshinones IIA Min Yang et al., 2006 „Characterization of […]“ zurück