1 / 18

SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek. Studium aktinu , mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocí dvou metod :. detekce přímo v buňkách - fluorescenční barvení

makan
Télécharger la présentation

SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ I Vlasta Němcová, Michael Jelínek, Jan Šrámek

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. SEPARACE A DETEKCE PROTEINŮ IVlasta Němcová,Michael Jelínek,Jan Šrámek

  2. Studium aktinu, mikrofilamentární složky cytoskeletu pomocídvou metod: • detekce přímo v buňkách- fluorescenční barvení • detekce po izolaci a následné separaci proteinů- SDS-PAGE(sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)

  3. METODA 1:Fluorescenční barvení –detekce F-aktinu, G-aktinu a DNA • F-aktin:phalloidinkonjugovaný s TRITC • G-aktin:DNáza I konjugovaná s Alexa Fluor 488 • DNA:DAPI • použité buňky – buněčná linie NES2Y(lidské -buňkyLangerhansových ostrůvků)

  4. Fixace – první krok přípravy vzorku • brání rozkladu a autolýze tkáně • cíl - zachování biologického materiálu v průběhu přípravy vzorku co možno nejblíže jeho přirozenému stavu Formaldehyd (= formalín) • vytváří kovalentní chemické vazby mezi proteiny v tkáni • rozpustné proteiny se naváží na cytoskelet • tkáň se stává rigidnější (snazší manipulace)

  5. Pracovní postup: • fixace buněk roztokem formaldehydu v PBS (phosphate buffered saline) • odstranění roztoku formaldehydu pomocí opakovaného promytí v roztoku PBS • inkubace buněk s phalloidinem-TRITC a DNázou I-Alexa Fluor 488 • odstranění nevázanéhophalloidinu-TRITC a DNázy I-Alexa Fluor 488 pomocí opakovaného promytí v PBS • barvení DNA pomocí DAPI • pozorování ve fluorescenčním mikroskopu

  6. METODA 2:Porovnání zastoupení aktinu v různých typech tkání pomocí metody SDS-PAGE (sodium dodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis = elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného)Izolace proteinů z různých typů tkání • použité typy tkání: • sval • srdce • játra

  7. Izolace proteinů z tkáně: • prvním krokem je dezintegrace tkáně a buněk • dezintegrace (lýza) buněk působením: • chemickým(používáme v našich experimentech) • mechanickým • fyzikálním

  8. Pracovní postup: Izolace proteinů • přenos tkáně do zkumavky • dezintegrace buněk pomocí lyzačního pufru obsahujícího SDS (sodium dodecylsulfát) • oddělení směsi proteinů od nezlyzované tkáně centrifugací Stanovení koncentrace proteinů • pomocí metody podle Bradfordové • použití BSA (bovine serum albumine = hovězí sérový albumin) jako standardu nezbytného pro vytvoření kalibrační křivky

  9. Separace proteinů pomocí metody SDS-PAGE • povaření vzorků se vzorkovým pufrem obsahujícímSDS • nanesení vzorků obsahujících požadované množství proteinůna polyakrylamidový gel • separace proteinů pomocí vertikální elektroforézy Identifikace proteinů • barvení gelu se separovanými proteiny v roztoku CoomassieBrilliant blue • lokalizace aktinu a ostatních proteinů v gelu, porovnání míry exprese v jednotlivých tkáních • chemiluminiscenční detekce aktinu (pouze demonstrace)

  10. Stanovení koncentrace proteinů • používány různé metody • všechny uvedené metody jsou založené na spektrofotometrickém stanovení (měření absorbance) • metoda podle Bradfordové(námi použitá metoda) • Lowryho metoda • BCA metoda (Bicinchoninová metoda) • stanovení z UV spektra, atd.

  11. Stanovení koncentrace proteinů metodou podle Bradfordové • příprava standardů pro sestavení kalibrační rovnice – několik vzorků proteinu o známé koncentraci (jako standard obvykle používán bovinní sérový albumin = BSA) • naředění lyzátu (koncentrace v rozsahu kalibrační přímky) • inkubace standardů a našich vzorků o neznámé koncentraci s činidlem Bradfordové • změření absorbance (A595 nm) • konstrukce kalibrační přímky • zjištění koncentrace proteinů v lyzátu výpočtem z rovnice kalibrační křivky

  12. Princip metody Bradfordové • kolorimetrická reakce po smíchání Bradfordova činidla s roztokem obsahujícím proteiny • Bradfordovo činidlo obsahuje barvivo Coomassie Brilliant Blue - váže bazické a aromatické aminokyselinové zbytky v proteinech(arginin (ARG), fenylalanin (PHE), tryptofan (TRY) a prolin (PRO))

  13. Coomassie Brilliant Blue • po navázání barviva na aminokyseliny dochází ke změně barvy roztoku z hnědé na modrou • detekce při 595 nm

  14. Kalibrační křivka

  15. Lowryho metoda • založená na detekci některých aminokyselin (tyrosin a tryptofan) • modré zabarvení roztoku (v závislosti na zastoupení obou aminokyselin ve vzorku) je detekováno při 500-750 nm

  16. Stanovení z UV spektra • stanovení koncentrace proteinů pomocí absorpce v UV spektru (260 - 280 nm) • závislé na přítomnosti aromatických aminokyselin v proteinech (tyrosin a tryptofan) • [Protein] (mg/mL) = 1.55*A280 - 0.76*A260

  17. BCA metoda • BCA = bicinchoninic acid • barevná reakce založena na interakci s peptidovou vazbou • purpurové zbarvení detekovatelné při 562 nm

More Related