Egészségkárosító kémiai hatások és megelőzésük Genotoxikológiai vizsgálati módszerek ismertetése

1. Egészségkárosító kémiai hatások és megelőzésük Genotoxikológiai vizsgálati módszerek ismertetése Előadó: Dr. Kocsis Zsuzsanna Országos Kémiai Biztonsági Intézet Budapest, Nagyvárad tér 2. Helyszín: ELTE, TTK 2009. 11. 14

2. A sejtmagban tárolt információ összessége a genom. Az emberi genom a két szülőtől származó,apai és anyai eredetű, DNS szálak közel azonos információkat tartalmaznak. A sejtosztódás során a DNS szálak fénymikroszkóposan látható kromoszómává tömörülnek.

3. Kromoszómaalak (morfológia) rövidkar centroméra hosszú kar • Kariogram: egy sejt/szervezet rendezett kromoszómakészlete • Kariotípus: a fajra jellemző kariogram testvérkromatid

4. A genotioxikológia az emberrel közvetlenül kapcsolatba kerülő anyagok mutagén hatását vizsgálja.Genotoxikus anyagok a DNS-ben tárolt genetikai információt örökletes módon megváltoztatják.

5. Mutáció: Egy tulajdonság egy nemzedéken belül ugrásszerűen, és öröklődő módon megváltozik.pl. enzimhiány, anyagcserezavarok, molekuláris megbetegedések Mutációk csoportosítása eredetük szerint*spontán mutáció: természetes körülmények közt minden fajra jellemző gyakorisággal lép fel. Prokariótáknál nagyobb, mint az eukariótáknál, a mitokondriális genomban nagyobb, mint a nukleáris genomban.*indukált mutáció: környezeti hatásra létrejövő ill. kísérleti körülmények között kiváltott mutációk.

6. Mutációk csoportosítása az érintett sejtvonal szerint: * szomatikus *germinálisMutációk csoportosítás a hatópont szerint:*gén- v. pontmutációk: *kromoszóma mutációk:MUTAGÉN TÉNYEZŐKsugárzás (röntgen, ultraibolya, radioizotópok)molekulákat gerjesztik és ionizálják.kémiai anyagok: hatásmechanizmusok alapján lehetnek: bázisanalógok interkaláló vegyületek alkiláló vegyületek N-nitróz vegyületek szabadgyököt képező vegyületek nehézfémek DNS-szintézis inhibitorok

7. Környezeti mutagén anyagok élelmiszeradalékok: nitritek, nitrátok nátriumbisziulfit ciklohexamin kozmetikumok: hajfesték (nitrofenilén-diamin) H2O2 femnilén-diamin diaminotoluol diaminoanizol gyógyszerek:citosztatikumok, altató és nyugtató szer antiallergiás gyógyszerek Meclizin fertőtlenítőszerek (formaldehid, H2O2) növényvédőszerek, herbicidek, insecticidek: klórozott szénhidrogének szerves-foszforsav észterek karbamidok, karbamátok, ftálamidok, szerves higanyvegyületek Vegyiparban használt köztes és végtermékek: epoxidok etilén-iminek acetaldehid akrilaldehid propán szulfon dimetil szulfát dietil szulféát dimetil-nitrózamin hidrazinok uretán etilén klorid vinil klorid Levegőszennyezés: policiklikus aromás szénhidrogének Szervetlen mikroszennyezők: nehézfémek azbeszt Szerves mikroszennyezők: gomba és baktériumok által termelt toxinok

8. KROMOSZÓMA ABERRÁCIÓ TÍPUSAI: Strukturális kromoszóma aberráció: deléció inszerció transzlokáció Numerikus kromoszóma aberráció: poliploidia aneuploidia

9. Deléció kromoszóma szegmentek elvesztése Különböző humán betegségek delécióra vezethetőek vissza. A kis deléciók tolerálhatóak. A nagy deléciók nem tolerálhatóak, letalitáshoz vezetnek. Egyes gének kiesésével a homológ kromoszómán hemizigóta állapot alakul ki. Egy recesszív tulajdonság felszínre jut. Ennek következménye, hogy a recesszív gén is megjelenhet a fenotípusban. Ezt a fenotípust pseudodominánsnak nevezzük.

10. Deléció citológiai detektálása Az 5-ös kromoszóma rövid karján deléciója • Macska nyávogásos betegség • Szellemi visszamaradottság • 4 év alatti halál születéskori gyakoriság: 1/50,000

11. DUPLIKÁCIÓ DUPLIKÁCIÓ: Kromoszóma szegmensek megkettőződése. Jó példa a duplikációra a Drosophila Bar mutációja.

12. Az X kromoszóma 16A régiójának kópia száma különböző

13. A gének evolúciójában fontos a duplikáció. Ha a gén fontos a szervezet számára nem változhat. De ha a génből több kópia van a képződő proteinek módosulhatnak és új funkciókat láthatnak el. Duplikációval keletkezett gén családok hasonló proteineket készítenek. Jó példa erre a globin gének, amelyekről α és β globin láncok szintetizálódnak, a hemoglobin szerkezeti alegységei.

14. Inverzió:Egy kromoszóma szakasz 180 fokos megfordulásának az eredménye. pericentrikus inverzió magába foglalja centromert paracentrikus inverzió a centromert nem érinti, csak a kromoszóma egyik v. másik karját

15. TRANSZLOKÁCIÓ: intrakromoszómális transzlokáció: Egy kromoszóma szakasz áthelyeződése ugyanabba a kromoszómába. interkromoszómális transzlokáció: Nem homológ kromoszómák közötti transzlokáció. Transzlokáció során nincs genetikai anyag vesztés. A gének pozíciója azonban megváltozik.

16. Down szindróma: • 14 és 21-es kromoszóma közötti Robertson transzlokáció. • A 21-es krom. transzlokációja a 14-es krom.-ra eredményezi a familiáris Down syndromát. • 21-es kromoszóma triszómia • Az anya életkorának előrehaladtával (40-45 év felett) az előfordulási gyakoriság exp. növekszik • Születéskori gyakorisága nagy: • 1/500-1/700

17. Myeloid leukémiaA 9-es és a 22-es kromoszómák közötti transzlokáció eredménye a “Philadelphia kromoszóma”Az esetek 90%-ban krónikus myeloid leukemiát okoz.

18. Burkitt’s lymphomaAz esetek 90% esetén a 8-as és 14-es kromoszómák közötti transzlokáció következménye.Transzlokáció következtében kialakuló pozíció effektus hatására kialakuló onkogének, sejtosztódást, rák keletkezését okozhatják.

19. Genotoxikus és daganatkeltő hatások vizsgálatának alapelvei • a vizsgálati anyag in vitro teszt rendszerekben mutagén-e ? • a vizsgálati anyag mutagén-e in vivo emlős szomatikus vagy ivarsejtekben ? • Ajánlott teszt rendszerek: • Egysejtűeken végzett tesztek • Rovartesztek • in vitro sejtkultúrákon végzett tesztek • in vivo mutagenitási tesztek • long term karcinogenitási állatkísérletek • humán epidemiológiai vizsgálatok

20. Alternatív toxikológiai in vitro vizsgálatok • előnyei: • in vitro körülmények között sejteken (élő állat alkalmazása nélkül ) • rövid idejű • olcsóbb • reprodukálható • nem használ élő állatot • Az esetleges hatás megállapításához több, különböző módszerrel végzett vizsgálat • egybehangzó eredményére van szükség. • A WHO Nemzetközi Rákkutató Ügynöksége (IARC) • 1. kategória: emberben bizonyítottan daganatkeltő hatású anyag

21. MUTAGÉN HATÁS VIZSGÁLATA In vitro módszer Kromoszóma aberráció in vitro vizsgálata emlős sejteken OECD TG 473 Gazdasági Együttműködési és Fejlesztési Szervezet (OECD) Célja: azon anyagok meghatározása, amelyek kromoszóma aberrációt okoznak emlősállat sejtekben. Kr

22. A kromoszóma aberráció vizsgálati módszer: • Sejtek • (Tud. történet: • Sejttenyésztés kezdeti lépései: • csirkeembrió/békaembrió, szövetdarab • 50-60 osztódás után öregedés jegyei. • 1940 egér L sejt fibroblaszt • 1951 méhnyakráksejt HeLa) • Alkalmazható sejtvonalak jellemzői: • stabil permanens v. primer sejtkultúrák (pl. CHO, humán lymfocita) • növekedési képesség stabilitás: megkettőződési idő stabil és rövid. • kariotípus stabilitás, állandó krom. szám. • Kromoszómák alaki változatossága és stabilitása. • Spontán kromoszóma ab. gyak. megfelelő, nem túl magas. • kínai hörcsög ovárium fibroblaszt sejt (CHO) • Tápfolyadékok, tenyésztési körülmények • (Természetes sóoldat, tojás fehérje, nyirok , vérplazma) • Mesterséges tápfolyadékok elterjedése (F12).

23. Vizsgálati anyag előkészítése: • kémiai összetétel, szennyeződés, stabilitás • oldószer kiválasztása • hígítási sor készítése • stabilitás vizsgálat (archiválás) • Előkísérlet: ctox vizsg. esetleg mitotikus index meghatározása. • Ctox: MTT-assay (mitokondriális szukcinát dehidrogenáz enzim) • MI: A metafázisban lévő sejtek és a sejtpopuláció összes sejtjének aránya. • A populáció proliferációjának a mértékét jellemzi. • Dózisok: • Legkevesebb három elemezhető dózis. • Citotoxikus anyag: ctox >50% a legmagasabb dózis. • Nem citotoxikus anyag: 5 mg/ml v. 0,01M

24. Metabolikus aktiválás: • S9 alkalmazása • rákcsálók enziminducerrel (Aroclor 1254, v. fenobarbiturát és β-naftoflavon) kezelt májából előállított poszmitokondriális frakció (S9) • kofaktorokkal kiegészítve • (ADPH, glukóz-6-foszfát). • S9 végkoncentráció 1-10% közötti. • citokróm P450 enzim aktiválása. • Indirekt mutagének kimutatására alkalmas

25. Kontrollok: • S9 nélkül: MMS, EMS, Mitomycin-C • + S9: CP, Benz(a)pirén • oldószer • Kezelési idők: • 4 óra +S9 • 4 óra -S9 • 24 óra -S9 • 48 óra -S9

26. Kolhicinezés: • Célja a metafázisos kromoszómák összegyűjtése • Őszi kikerics (Colchicum autumnale) hagymájából készült kivonat. Köszvény gyógyítására alkalmazták. A kolhicin sejtosztódás gátló, a mitózis metafázisában. • Normál esetben a sejtek 2-5%-a osztódik, néhány órás kolhicinezés összegyűjti a sejteket a metafázisban, akár 40-50 %-uk is blokkolt metafázisban található. • A kolhicin a magorsó mikrotubulusaihoz kötődik.

27. Kromoszóma preparálás

28. Fénymikroszkópos értékelés • kromatid típusú aberrációk:kromoszóma típusú aberrációk: • deléció deléció • exchange exchange