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Mapas de Restricción. Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé , PhD. Objetivos. Al completar este ejercicio los estudiantes 1. Habrán usado enzimas para digerir un plásmido 2 . Analizaran los resultados con una electroforesis de agarosa .
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Mapas de Restricción Biol 3030 – Lab Desarrollo JA Cardé, PhD
Objetivos Al completaresteejercicio los estudiantes 1. Habránusadoenzimasparadigerir un plásmido 2. Analizaran los resultados con unaelectroforesis de agarosa. 3. Calcularánlasdistancias entre los puntos de corte de lasenzimasusadas 3. Determinaránlasposicionesrelativas entre estoscortes
Análisis Plasmido de 5000bp Enzimas ABC Cualquiera sola 5000bp Double Digest AC – 3000, 2000 AB – 4500, 500 BC – 3,500, 1500 Plasmido de 5000bp Enzimas ABC– 3000, 2500, 500
Marcadores En esteexptodeterminaraslaslocalizaciones de sitios de restriccion en el plasmido. Se usaranfragmentospara el tamano
Reactivos Las enzimas con HindIII y Bgl 1 Asume a Bgl1 en 0 Calculalasdistancias entre los puntos de corte y determinalasorientacionesrelativas.
InstruccionesGenerales • Anadirenzimas, mezclas de reaccion al DNA • Mezclar con fingertiop vortex • Incubar a 45 o 37 en baño de María • Añadir loading buffer paradetener la reacción.
Instrucciones de Reacciones • Rotular 4 tubos (del 1-4) paracuatroreacciones de enzimasde restricción • Golpear los tubos contra el bench pararecoger el contenido en el fondo • Servir 30µl de buffer de Rxn en cadatubo • Añadir DNA, agua y enzima a los tubos de reacciónsegúnresumido en la tabla. • Tapar el tubo y mezclarcuidadosamente. Vigile la fase del glicerolque no se acumule • Spin parabajartodo el contenido al fondo • Incubar 15 o 60 min a 45 o 37 gradosrespectivamente • Añador X ul de loading buffer a los tubos de reaccion, mezle y estalistaparaservir.
Instrucciones de Gel • Preparar gel al 0.8% de 6 carriles con pozos de 40µls. • Puedenser 2 geles de 15 carriles • Servir • 1 marcador • 2 Plasmido sin cortar • 3.Corte con HindIII • 4.Corte con Bgl • 5 Corte con HindIII y Bgl I
Grafica: Determinación de Tamaño de los fragmentos -Medir y registrar distanciamigradaporcadabanda del marcador (excpto el de 23,130, que no caerá en la linea) Mida y anote en cm Rotulepapelsemilog con Distancia en X en cm Rotula Log base pair en Y. Escoja la escala de maneraque los puntosquedenbiendistribuidos Ciclos de 100 – 1000, de 1000-10000 Ubiquecadapunto en la grafica con Distancia y sutamano en Y Dibuja la mejorlineaquepaseportodos los puntos (Igualnumero a cadalado de la linea) Mida la distancia de cadabandadesconocida Extrapola en la linea recta los valores de los desconocidos
Preparación del mapa • Prepare un mapa circular del plasmido de 4340. Marque la posicionparacortes de HindIII de acuerdo a los tamanos de la gel • Dibuje un segundocirculo de 4340. Marque la posicion del corteparaBglI en la parte superior lo queserianlas 12. • Para dibujar el mapacompuestocoloqueuno de los circulossobre el otro. • Mantenga el de BglI a las 12 y rote el otrodibujo hasta que la distancarelativa entre los sitios de restriccionaproximen los tamanosrelativos a los fragmentos de la digestion • Compare los tamanos de los fragmentos de lasdigestiones simples con los de lasdobles.
