Replicarea ADN «There must be two if life shall succeed…»

1. Replicarea ADN «There must be two if life shall succeed…» -cantec popular danez-

2. CE ESTE REPLICAREA ADN? • Biosinteza ADN • Are loc astfel încît să fie asigurată stabilitatea genetică în organism şi în cadrul speciei (este o modalitate specifică de biosinteză care permite conservarea şi transmiterea informaţiei genetice de la o generaţie la alta).

3. S phase G1 G2 interphase Mitosis -prophase -metaphase -anaphase -telophase Cînd şi unde are locreplicarea ADN? La eucariote replicare are loc doar în faza S, de sinteză, a ciclului celular, faza separată de faza mitotică M prin perioadele de gol (gap) sintetic G1 şi G2. • Faza S a ciclului celular • Nucleu

4. REPLICAREA ADN PE SCURT • Dublul helix al ADN se desface şi se construiesc pe fiecare dintre cele două catene parentale (numite catene matriţă sau template) cîte o catenă complementară replica celor parentale.

5. Replicarea– cu ceva mai multe detalii 1. Dublul helix se desface. 2. La joncţiunea dintre cele două catene parentale desfăcute ia naştere bifurcaţia de replicare. 3. O nouă catenă se formează prin Împerecherea nucleotidelor libere cu bazele complementare de pe catena veche. 4. Rezultă două molecule-fiice de ADN care conţin cîte o catenă Parentală şi o catenă nouă.

6. CARACTERISTICILE REPLICARII ADN • semi-conservativă • completă • bi-direcţională (deşi are loc întotdeauna în direcţia 5’ 3’ !!!) • semi-discontinuă

7. 1. Replicarea ADNestesemi-conservativă (Meselson-Stahl, 1958). • Fiecare moleculă fiică de ADN conţine o catenă parentală intactă asociată cu o catenă nou sintetizată.

8. Meselson & Stahl’s Famous Experiment (1958)

9. 2. Replication estecompletă • Replicarea ADN antrenează întregul cromozom, rezultand doi cromozomi identici. Cromozom circular (procariote)

10. 3. Replicarea ADNestebi-direcţională(Cairns, 1963). • Replicareaîncepe într-un punct bine determinat numit origine de replicare(ori) şi pornind din acest punct se derulează simultan în ambele direcţii. bidirecţional

11. Reiji Okazakia propus şi demonstrat în 1968 că în timp ce sinteza unei catene (catena leading)este continuă, sinteza celei de-a doua catene(catena lagging )este discontinuă (în runde de 150-250 nt). 4. Replicarea estesemi-discontinuă

12. Întrebare: • Următoarele afirmaţii în ceea ce priveşte replicarea ADN sunt corecte: • Replicarease realizează pe anumite porţiuni din cromozom. • SintezaADN pe catena lagging este continuă. • Fiecare moleuclă fiică de ADN conţine două catene nou sintetizate. • Fiecare catenă a ADNdc acţionează ca matriţă/template pentru o nouă catenă de ADN.

13. Elementeleesenţiale necesare replicării • Sunt necesare cincielemente esnţiale : • ADN parental- matriţa (fiecare catenă de ADN serveşte ca matriţă) • cele 4dezoxiribonucleozid trifosfaţi dNTP (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) • cele 4ribonucleozid trifosfaţi NTP(ATP, GTP, UTP, CTP); aceasta sugerează necesitatea sintezei de ARN în cursul sintezei de ADN!!! • Proteine specifice, majoritatea enzime • Mg2+

14. Proteinespecifice implicateîn replicare

15. Primazasintetizează unARN primer pe matriţă de ADN SSB stabilizează ADNmc Helicase desface dublu helix Ligazaleagă/coase fragmentele de ADN (frag. Okazaki). ADN polimeraza I (exonucleaza) înlocuieşte ARN primer cu ADN ADN polimeraza III leagă nucleotidele pt. a forma noul ADN Enzimele implicate în replicarea ADN

16. Proteine implicare în replicarea ADN laE. coli (aproximativ 30 proteine)

17. Helicazadesface dublul helix • Proteina DnaB • Hexamer • Catalizează un fel de denaturare in vivo a ADN (catenele dezrăsucite pot fi citite de către enzimele replicării) • necesită energie; consumă 2 molecule de ATP per 2 legături de hidrogen desfăcute.

18. Single stranded proteins (SSBs) • Tetramer • Se leagă de cele două cateneADN şi le menţine separate prevenind renaturarea lor • Prezintă o cavitate de 15Å încărcată pozitiv • Trebuie să fie îndepartate înainte ca noua catenă de ADN să poată fi sintetizată

19. Topoisomerazele • enzime care rezolvă tensiunile sterice (torsiuni +, de dreapta) apărute în cursul dezrăsucirii (cu o viteză de 100 revoluţii/sec !!!) duplexului ADN, şi care ar putea bloca replicarea

20. Enzima Enzima ADN Clase de topoizomeraze: topoizomeraza I • acţionează ca o endonuclează reversibilă, printr-un mecanism de tăiere-coasere care permiterotaţia liberă a ADNmc (acţiune de suveică) . • “economică” (nu necesită aport energetic):hidrolizează o legătură fosfat diesterică a cărei energie o conservă într-o legătură fosfat esterică implicînd Tyr din centrul activ al enzimei şi ulterior o foloseşte la refacerea catenei incizate coasere tăiere relaxare

21. Clase de topoizomeraze: topoizomeraza II • ADN-giraza • Dimer • Introduce în molecula de ADN supertorsiuni (-), spre stînga, în sens contrar celor create de înaintarea bifurcaţiei de replicare; astfel compesează în avans constrîngerile impuse de desrăsucirea duplexului de ADN • Necesită energie (consum de ATP) • Acidul nalidixic, Norfloxacinul (Ab cu toxicitate redusă, care nu dezvoltă rezistenţă plasmidică transferabilă)- inhibă activitatea ADN-girazei

22. ADN polimerazele-ADN dependente: • Copiază catena matriţăîn direcţia 3’ 5’ • Sintetizează catena nouă în direcţia 5’ 3’: formează legături fosfat diesterice între două dNTP vecine dictate de template, prin atacul nucleofil realizat de către gruparea 3’-OH al primului nucleotid asupra grupării α fosfat din dNTP următor) • Necesităun primerdeoerece nu poate initia sinteza unei catene noi (ARN-ul sintetizat de primază serveşte drept primer) • AUTO-CONTROL: Au activitate 3' -> 5' exonucleazică, care stă la baza capacităţii de autocontrolsau de PROOF-READING:desface nucleotidele greşit împerecheiate de la capătul 3’ al catenei în creştere. • PROCESIVITATE (Procesivitatea este capacitatea polimerazei de a se menţine legată de matriţă; este o expresie a numărului de nucleotide adăugate la lanţul ADN în creştere înainte ca polimeraza să se disocieze de matirţă)

23. REACTIA CATALIZATĂ DE ADN POLIMERAZĂ Cap 5' P P Base Base CH2 CH2 O O P P CH2 CH2 Base Base O O H20 + 3' P P P P Piro- fosfat OH P Base CH2 P O CH2 5' Base O OH 3' Cap 3‘(în creştere) OH

24. Clase ADN polimeraze -ADN dependente: • procariote: • ADN pol I, II, III, IV, V • eucariote: - ADN pol α, β,γ, ε, δ

25. ProprietăţileADN polimerazelor la procariote

26. EsteADN polimeraza I polimeraza replicativăprincipală?

27. DNA polimeraza I nu este polimeraza replicativă principală! • Enzimaesteprea lentă!ADN polimeraza I catalieazăîncorporarea dNTP cu o viteză maximă de 20 nt/sec: ar avea nevoie de 53 zilepentru a replica integral cromozomulE. coli, care în realitate se divide la fiecare 20 min. • Enzimanu este suficient de procesivă. • Enzimaesteprea abundentă.Există aproxiamtiv 400 molecule de ADN polimeraza I per celulă E. colişi doar 2 bifurcaţii de replicare per celulă. • Celuleleprezentînd mutaţii polA1sunt viabile.

28. DNA polimeraza III este polimeraza replicativă • Proprietăţile ADN pol III sunt potrivite pentru o enzimă care deţine un rol central în replicarea ADN: are o procesivitate foarte mareşicatalizează polimerizareala oviteză foarteînaltă(250-1000 nt/sec). • Sinteza catenei leading.

29. La ce foloseşte activitatea 5’-3’exonucleozică, specifică acestei polimeraze? La ce foloseşte activitatea polimerazică a ADN pol I ? Îndepărtarea primerului de la capătul 5’ al lanţului în creştere Sinteza catenei lagging, înlocuirea cu dNTP a locului lăsat liber de primer şi repararea leziunilor ADN (ex. leagă dNTP pe locul liber apărut după îndepărtarea baze greşit împerechiate) Care este rolul ADN polimerazei I?

30. ADN polimerazelela procariote (continuare) • ADN pol II este implicată în reparea leziunilor ADN (are activitate 3' -> 5‘ exonucleazică. • ADN pol IV - Pol IVeste o ADN polimerază predispusă la erori de împerechere (nu are activitate de proof-reading ca la pol III, pol II şi pol I) - Pol IVeste responsibilăde 50% din mutaţiile adaptative. • ADN pol V - Pol Vaparţineunei căi speciale de reparare (un fel de “ultima barieră“)denumită calea SOS de reparare a ADN. - Pol Veste sintetizată cînd celula este expusă la doze mari de radiaţii sau de mutageni, cînd pot să apară lez. majore ADN.

31. Proprietăţile ADNpolimerazelor la eucariote

32. Primaza: • Sintetizează oligoribonucleotidul (ARN primer) iniţial pe care se ataşează ADN polimeraza. • ARN primer este formatdin 4-12 ribonucleotide. • Noua catenă de ADN se constuieşte prin adăugarea de nucelotide la capătul 3 al ARN primer. - ARN primer e înlocuit în final cu ADN.

33. Întrebare: ADN polimeraza: A. Initiază sintezalanţului polinucleotidic B. Sintetizează un lanţ polinucleotidic în diercţia 3’- 5’ C. Citeştematriţa de ADN în direcţia 5’- 3’ D. Produce cîte o moleculă de pirofosfat la adăugarea fiecărei nucleotide la catena în creştere.

34. ETAPELE REPLICĂRII ADN (şi elementele-cheieale fiecărei etape) Iniţierea: primozomul-un complex de proteine şi originea replicăriiori Elongarea: replizomul-un complex de proteine, asociate cu ADN cu rol în sinteza catenelor noi de ADN Terminarea: proteina Tus protein situsul de terminare ter

35. REPLICAREA ADNLA PROCARIOTE

36. 1. INIŢIEREAcontroleazăîntregul proces de replicare!

37. Originea replicării 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 3’ Iniţierea replicării • Identificarea originiide replicare • Dezrăsucirea mediată de către helicază (denaturarea) duplexului ADNcu fomarea ADNmc şi a bifurcaţiilor de replicare • LegareaSSBlaADNmc • Formareaprimozomului (conţine şi primaza) • SintezaARN primer

38. oriC Originea replicării • Originea replicării (oriC) esteo regiune de 245 perechi bazebogată în AT • OriC este recunoscută de cătreproteina dnaA care se leagă la oriC, şi careîmpreună cuproteina dnaB (helicaza) desface ADNdc (folosind ATP).

39. Primozomul- elementul cheieal iniţierii- • Primozomuleste un complex de proteine care este format din: - dnaB (helicază) - dnaC (şaperon al dnaB: asistăplicaturarea dnaB) - primaza - alte proteine • Primozomul se deplasează împreună cu bifurcaţuia de replicare, consumînd ATP • Primozomul este responsabilpentru sinteza ARN primer.

40. 2. ETAPA DE ELONGARE

41. 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ 5’ Etapa de elongare • Sinteza de ADN prin adăugarea de dezoxiribonucleotide (una cîte una)iniţial la capătul 3’ al ARN primer, ulterior la capătul 3’ end al catenei în creştere.

42. Etapa de elongare • Catena parentală 3’- 5’ (care este citită în aceeşi direcţie cu deplasarea bifurcaţiei de replicare) este copiatăcontinu. • Catena nouă astfel sintetizată este catena“leading”.

43. Etapa de elongare -Catena parentală5’-3’ (care este citită în direcţie opusă faţă de deplasarea bifurcaţiei de replicare) este copiatădiscontinu. Catena nouă astfel sintetizată este catena “lagging” şieste sintetizatăîn fragmente mici (1fragment per rundă sinteză)-fragmentele Okazaki

44. Etapa de elongare • Replicarea ADN la E. coli are viteza ~1000 nt/s • Polimeraza III (subunitatea b) formeazăun inel care alunecă pe ADN matriţă şi care creşte procesivitatea miezului Pol III de la 10-15 la>5000 perechi bază • 35Å diametru; (+) interior, (-) exterior

45. ori ter Replication Forks Replicarea bidirectionala a cromozomului circular la procariote produce un intermediar în forma literei Theta.

46. Replizomul- elementul cheie al elongarii- • complex de proteins care cuprinde toate enzimele şifactorii necesari replicării ADN. • Probabil ataşat de membrana nucleară, iar ADN ar străbate replizomul. • este responsibil pentru sinteza a două catene noi de ADN.

47. 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ 3’ Primase 5’ Single strand binding proteins Laging Strand 5’ 5’ 3’ 5’ RNA Primers DNA Polymerase 5’ 3’ Helicase Leading Strand 5’ 3’ Schema etapelor de iniţiere şi elongare Okazaki fragment

48. 3. ETAPA DE TERMINARE

49. oriC Terminareareplicării • Regiunea de terminare: - situată la 180 grade faţă deori; conţine “capcane” petur bifurca’ia de replicare - la acest nivel bifurcaţiile de replicare se întîlnesc şi dezleagă catenele de ADNîncă asociate. • Situsurile de terminare • sunt porţi care permit trecerea bifurcaţiei de replicare într-un singur sens; - conţin 23 perechi de baze TerD TerA TerC TerB

50. Terminarea Replicarii Un set desitusuri Teroprescbifurcaţia de replicare care progresează în sensul acelor de ceasornic, al 2-lea set blochează bifurcaţia de replicare care avansează în Invers acelor de ceasornic: Cromozom TerA TerB Situsurile Ter forţează cele două bifurcaţii de replicare să se întîlnească într-un punct specific.