蛋白质组学

蛋白质组学

背景 基因数量有限性和基因结构的相对稳定性 VS 生命现象的复杂性和多变性从genomic到proteome

对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务。

The era of ‘omics’-based science • Genomics （基因组学） • Post-genomic science （后基因组时代） • Functional genomics （功能基因组学） • Transcriptomics（转录组学） • Proteomics （蛋白质组学） • Metabolomics （代谢组学） • Structural genomics （结构基因组学） • Aim - 3D structures of all protein folds !

主要内容 第一节蛋白质组学的概念及发展进展第二节蛋白质组表达模式的研究方法第三节蛋白质组功能模式的研究方法

第一节 蛋白质组学的概念及发展进展

蛋白质组和蛋白质组学的概念 蛋白质组（proteome）：PROTEins + genOME，意思是Proteins expressed by a genome（基因组表达的所有蛋白质）。 1994年由Williams和Wilkins提出，是一个动态的概念，指的是不同细胞在不同时相表达不同的蛋白质。

蛋白质组： • 对应于基因组的所有蛋白质构成的整体，不是局限于一个或几个蛋白质。 • 同一基因组在不同细胞、不同组织中的表达情况各不相同。 • 在空间和时间上动态变化着的整体。

蛋白质组学(proteomics) 指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。

主要研究内容 了解某种特定的细胞、组织或器官制造的蛋白质种类；明确各种蛋白质分子是如何形成类似于电路的网络的；描绘蛋白质的精确三维结构，揭示其结构上的关键部位，如与药物结合并且决定其活性的部位。

蛋白质组研究包括两个方面： Proteomics 表达蛋白组学 The study of global changes in protein expression 蛋白质组功能模式 The systematic study of protein-protein interactions through the isolation of protein complexes

基因组转录组 蛋白组 • The study of proteins expressed by genomes • Completion of the sequencing of the 1st draft of human genome indicates there are approximately 250,000 proteins in the human genome • Only 2-5% of proteins in human genome have been identified

功能蛋白质组学(functional proteomics)的提出 • 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有蛋白质。 • 介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质为研究对象的蛋白质组学之间。

从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体。 • 将多个亚群体组合起来，逐步描绘出接近于生命细胞的“全部蛋白质”的蛋白质组图谱。

发展进展 各国政府支持，国际著名研究和商业机构加盟： 1996年澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心（Australia Proteome Analysis Facility，APAF）

美国国立癌症研究院（NCI）投资1 000万美元建立肺、直肠、乳腺、卵巢肿瘤的蛋白质组数据库。 NCI和FDA共同投资数百万美元建立癌症不同阶段的蛋白质组数据库。英国建立三个蛋白质组研究中心对已完成或即将完成全基因组测序的生物体进行蛋白质组研究。

Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。Celera公司投资上亿美元独自启动了全面鉴定和分类汇总人类组织、细胞和体液中的蛋白质及其异构体，构建新一代的蛋白质表达数据库的工作。

1997年召开了第一次国际“蛋白质组学”会议 1998年在美国旧金山召开了第二届国际蛋白质组学会议 1999年1月在英国伦敦举行了应用蛋白质组会议

我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会我国也于1998年启动了蛋白质组学研究，在中科院上海生物化学研究所举办了两次全国性的蛋白质组学研讨会

2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。2003成立了中国人类蛋白质组组织（CHHUPO），并分别于2003年9月、2004年8月以及2005年8月召开了中国蛋白质组学首届、第二届及第三届学术大会，2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会议。

科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。科技部已将疾病蛋白质组研究列入我国“973”计划项目和“863”计划项目；国家自然科学基金委员会也将“蛋白质组研究”列为重点项目。 • 我国在鼻咽癌、白血病、肝癌和肺癌蛋白质组研究方面取得了较大的进展。

第二节 蛋白质组表达模式的研究方法

主要研究目标 • 研究蛋白质组组成成分、差异和功能

（一）蛋白质组研究中的样品制备 • 通常可采用细胞或组织中的全蛋白质组分进行蛋白质组分析。 • 也可以进行样品预分级，即将细胞或组织中的全体蛋白质分成不同部分，分别进行研究。

样品预分级的主要方法 • 蛋白质溶解性：可溶性蛋白、非溶性蛋白等 • 蛋白质定位：膜蛋白、核蛋白等 • 蛋白质细胞器定位：线粒体、高尔基体、叶绿体等

样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。样品预分级主要作用在于提高低丰度蛋白质的上样量和检测灵敏度。

组织水平上的蛋白质组样品制备 临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤中癌变的上皮类细胞总是与血管、基质细胞等混杂。

激光捕获显微切割(laser capture microdissection，LCM) 可直接在显微镜下从组织切片中精确分离特定的细胞或细胞群。

（二）蛋白质组研究中的样品分离 • 双向凝胶电泳two-dimensional electrophoresis，2-DE)：利用蛋白质的等电点和分子量，结合凝胶化学特性，分离各种蛋白质的方法。

特点 • 可分离10～100 kD分子量的蛋白质 • 高灵敏度和高分辨率 • 便于计算机进行图像分析处理 • 与质谱分析匹配

2-DE技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。

新型非凝胶技术 液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE

（三）常见蛋白质显色技术 • 考马斯亮蓝染色

常见显色方法比较

考染和银染的比较

有机染料和银染 • 考染灵敏度为30~100ng，线性范围是20倍；银染的线性范围是40倍，灵敏度是考染的100倍。 • 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限灵敏度为8~10ng，但这种染液会对蛋白质进行修饰而影响质谱分析的结果。 • 胺基黑常用于转印至聚偏二氟乙烯（PVDF）和/或硝酸纤维素膜上的蛋白质的染色。 • 银染的缺点是：对某些种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成影响。 • 这两种染色技术都可减少胶内蛋白质产量。

负染 • 能专门提高PAGE胶上蛋白质的回收率，但不能用于膜上染色。 • 结果表现为胶面着色而蛋白质点透明。 • 速度快（5~15min），蛋白质的生物活性能保持：一旦用络合剂如EDTA或Tris/甘氨酸转移缓冲液来络合金属离子就可进行提取来转移蛋白质。 • 它主要适用于蛋白质显色、完整蛋白质的胶上被动提取以及质谱分析。 • 该技术主要包括金属盐染料、锌－咪唑染料等的使用。

胶体扩散染料 • 主要用于高灵敏度检出电转印至硝酸纤维素和PVDF膜上的蛋白质，不用于胶内染色。 • 最好的胶体金染色的灵敏度与PAGE胶内的银染类似。 • 这种技术主要包括印度墨水染料、胶体金属染料等。

有机荧光团染料 • 包括共价结合和非共价结合的荧光团染料两类。后者最为常用，其典型代表是已经商品化的SYPRO Red、 Orange、 Ruby等荧光染料。 • 这三种染料可对SDS-PAGE胶内蛋白质进行一步染色，约30~60min完成，灵敏度为2~10ng。染色后的凝胶用标准的实验室300nm紫外透射仪进行照像保存，其线性范围为3个数量级。 • 这三种染料的电泳染色结果与在酵母中通过SAGE所获得的基因表达水平的动态范围相匹配。 • 在Tris/甘氨酸转印缓冲液中染色后，蛋白质可被转印至膜上并进行免疫染色或Edman测序来鉴定蛋白质。

金属螯合染料 • 这是一类与现代蛋白质组学研究相兼容的、相对较新的蛋白质显色试剂，其设计专门与常用微量化学表征过程兼容。它们不包含戊二醛、甲醛或Tween-20等，很容易和集成化蛋白质组学平台（包括自动化凝胶染色仪、图像分析工作站、机器人剪切仪器、蛋白质酶解工作站和质谱仪等）相结合。 • 其中SYPRO Ruby也是一种基于钌的金属发光染料。

（四）凝胶的图像处理分析和胶内酶切 • 凝胶图像的扫描： • 图像加工： • 斑点检测和定量： • 凝胶配比： • 数据分析： • 数据呈递和解释： • 2-DE数据库的建立：

目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析:目前有多种图像分析软件可用于胶的图像分析: MelanieII (BioRad), PD Quest (BioRad), Phoretix 2D Full, (Amersham Pharmacia Biotech) ImageMaster 2d Platinum • 这些软件可以完成蛋白质点的识别、匹配等，具有很强的分析功能，但其缺点是需要很多的图像手工校对，

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