Metodos de purificación

1. Metodos de purificación Basado en las siguientes propiedades proteicas: • Tamaño • Solubilidad • Carga • Adsorción • Afinidad CAROLINA VITA

2. Característica Procedimientos Tamaño • Dialisis – ultrafiltración • Electroforesis en gel • Cromatografia de exclusión molecular • Ultracentrifufacion Solubidad • Precipitación con Sales • “ Solventes organicos • ‘’ por pH Polaridad • Cromatografia de absorción • C. En papel • C. En fase reversa • C. De interaccion hidrofóbica Carga • Cromatografia de intercambio iónico • Electroforesis • Isoelectroenfoque Selectividad • Cromatografia de afinidad

3. Cromatografias de exclusión molecular • Separan por tamaño • Las columnas rellenas polimeros inertes Insolubles pero muy hidratados Sephadex: polimeros de dextrano Sepharose: agarosa Superose: agarosa entrecruzada Sephacryl: dextrano-bisacrilamida Superdex: agarosa y dextrano

4. . Exclusión molecular 1.La columnase equilibra con el buffer de corrida 2.Aplicación de la muestra (0.5 - 5% volumen de columna) 3. Elución.

5. Exclusión molecular • Separa mezclas de proteínas por tamaño • De macromoléculas diferente • De grandes estructuras celulares como ribosomas • Determinación de PM

6. Volumen de exclusión Proteínas de gran tamaño no penetran los poros permaneciendo en el volumen de exclusión de la columna Vo

7. Determinacion de PM Se determina Vo con Blue Dextran Ve se determina para cada proteína Vt se calcula de la fórmular 2 x h Kav =Ve-Vo / Vt-Vo Kav Log Mw

8. CARGA • Los grupos R en las proteínas globulares se encuentran sobre la superficie exterior de la molécula, aunque también pueden tener grupos ocultos o participando de puentes de H • Carga  depende de las propiedades ácido – base de los grupos R

9. Matriz Nombre Dextrano Sephadex Agarosa Sepharose CL-6B CelulosaSephacel Cromatografía de intercambio iónico Un intercambiador iónico consiste en una matriz porosa con grupos cargados unidos covalentemente. Estos grupos se asocian con iones de la fase móvil (contraiones), estos pueden intercambiarse por otros iones de las misma carga sin alterar la matriz. La matriz generalmente es un compuesto inorgánico, resinas sintéticas o polisacáridos.

10. Grupos cargados • Son una propiedad fundamental del intercambiador. • Determina el tipo y la fuerza del intercambiador • El número total y su disponibilidad determinan la capacidad del intercambiador • Los de carga negativa adsorben cationes mientras que los de carga positiva adsorben aniones. • Así se llaman intercambiadores catiónicos y aniónicos respectivamente.

12. Mecanismo de separación • Separa a moléculas por carga neta. • Grupos cargados unidos a la matriz adsorben muestras de carga opuesta(reversible) • La desorción se logra a través el cambio del pH o aumentando la concentración de sal del eluyente. • Fig 1.1. las moléculas cargadas se absorben en los en los intercambiadores de carga opuesta. La interacción es un equilibrio dinámico que puede estar influenciado por pH como por la concentración de las sales. Cromatografía de intercambio iónico(IEX)

13. Fig 1.2. El tamaño de la fecha representa la fuerza de la adsorción Adsorción • Proteínas poseen aa cargados en su superficie, se adsorben sobre el intercambiador • Proteínas con carga neta negativa se absorben a I. catiónicos, • La fuerza de adsorción aumenta con el aumento de carga neta. • La carga de los aa depende del pH. • la carga neta dependerá del pH de una manera que es bastante específica para cada proteína individual.

14. Existen 2 posibilidades • Reducir la carga neta cambiando el pH. • Agregar un ión que compita por las cargas del intercambiadorEn IEX se utiliza una sal monovalente como NaCl, ya que tiene poco efecto sobre el pH de la corrida.Fig 1.3. A mayor carga neta, mayor es la adsorcion y mayor la concentracion de sales que se necesita para desorber la muestra Desorción

15. 1. El buffer se bombea por la columna hasta que la [salina] y el pH lleguen a un equilibrio 2. La muestra se aplica , se adsorbe y se lava con buffer 4. Regeneración de los componentes cargados hasta remoción completa. • 3. El gradiente comienza y los componentes adsorbidos de la muestra comienzan a eluir en función de su carga neta. Elution order: Separación de proteínas usando gradiente de NaCl