Szybkość translacji niektórych białek zależy od poziomu żelaza w komórce

1. Szybkość translacji niektórych białek zależy od poziomu żelaza w komórce Ferrytyna – białko komórkowe magazynujące żelazo (4500 Fe / 1 cząsteczkę białka). Gdy w komórce brakuje żelaza, poziom ferrytyny może ulec obniżeniu. eALAS – (syntaza 5-aminolewulinianu erytrocytów; syntaza d-aminolewulinianowa, pierwszy enzym w syntezie hemu, prowadzi) kondensację glicyny i bursztynylo-CoA). Jeśli brakuje żelaza, niepotrzebny jest wysoki poziom tego enzymu. Receptor transferyny – białko w błonach komórkowych umożliwiające wychwytywanie z osocza obładowanej żelazem transferyny. (Transferyna – białko osocza transportujące żelazo). Przy braku Fe w komórce – poziom receptora dla transferyny powinien się podnieść.

2. Ferrytyna Zbudowana z 24 identycznych łańcuchów białkowych, tworzących powierzchnię kuli. Wnętrze kuli zajmują jony żelaza. http://pubs.chee.uh.edu/faculty/vekilov/protein/default.htm http://www.cdc.gov/ncbddd/hemochromatosis/training/pathophysiology/iron_cycle_popup.htm

3. Szybkość translacji niektórych białek zależy od poziomu żelaza w komórce Fe-translacja mRNA ferrytyny Fe- translacja mRNA eALAS Fe- translacja mRNA receptora transferyny W UTR tych mRNA znaleziono charakterystyczne struktury/sekwencje nazwaneIRE IRE – Iron Responsive Element mRNA ferrytyny i eALAS - 5’UTR mRNA receptora transferyny - 3’UTR

4. IRE – Iron Responsive Elements • Występują w 5’ lub 3’ UTR mRNA kodujących białka zaangażowane w gospodarkężelaza. IRE w 5’ UTR spełnia inną rolę niż IRE w 3’ UTR. • IRE to mała pętla szpilki do włosów, zbudowana z ramienia 5 par zasad i pętli składającej się z 6 nukleotydów o sekwencji 5’-CAGUGN-3' przy czym N to dowolny nukleotyd ale nie G. • Sama struktura IRE nie stanowi przeszkody dla małej podjednostki rybosomu przy skanowaniu 5’ UTR.

5. IRE – Iron Responsive Elements IRE może przyłączać z wysokim powinowactwem IRP- Iron Regulatory Protein. Istnieją dwa IRP: IRP1 i IRP2. IRE – elementy cis-regulatorowe IRP – elementy trans-regulatorowe Kompleksy IRE/IRP stanowią przeszkodę przy skanowaniu 5’UTR przez małą podjednostkę rybosomu. IRP są białkami żelazo-siarkowymi, zawierają centra żelazo-siarkowe

6. Mechanizm działania IRP1

7. struktura IRP1

8. Mechanizm działania IRP2 W obecności żelaza IRP2 jest bardzo podatne na proteolizę. Gdy pojawia się żelazo IRP2 jest degradowane. Przy braku żelaza IRP2 nie ulega degradacji i wiąże się z sekwencjami IRE

9. Regulacja translacji mRNA ferrytyny i eALAS Fe  IRP-1 pozostaje związane z żelazem (z centrami żelazo-siarkowymi) i nie oddziałuje z IRE.  IRP-2 ulega degradacji. Zachodzi bez przeszkód translacja mRNA ferrytyny i eALAS ferrytyna eALAS  Fe  IRP-1 i IRP-2 przyjmują konformację o wysokim powinowactwie do IRE; wiążą się z IRE i blokują translację ferrytyny i eALAS. ferrytyna eALAS 

10. Jak funkcjonują IRE w kontroli translacji mRNA receptora transferyny (TfR)

11. Degradacja mRNA • mRNA różnych białek ulegają degradacji z różną szybkością. • Badania tego procesu są najbardziej zaawansowane u drożdży (możliwość analizy różnych mutantów) • Rozkład mRNA u drożdży zachodzi wg. schematu obejmującego 3 etapy (3xD): • usunięcie poly-A DEADENYLATION • usunięcie czapeczki DECAPPING • degradacja DEGRADATION • Deadenylacja: sekwencja polyA skraca się sukcesywnie do ok. 10 nukleotydów. Jest to najmniejsza długość wystarczająca do wiązania białka Pab1p (polyA-binding protein). Dalsza deadenylacja wiąże się z utratąPab1p. • U ssaków homolog Pab1pto PABP

12. Degradacja mRNA Usunięcie czapeczki („decapping”) zachodzi przez hydrolizę wiązania w obrębie trifosforanu pomiędzy metyloguanozyną a kolejnym nukleotydem. Tu (u drożdży) działają białka Dcp1p oraz Dcp2p (Decapping protein) wraz z kilkoma białkami pomocniczymi. Po usunięciu czapeczki zachodzi degradacja całego mRNA przez egzorybonukleazę. U drożdży przeważa degradacja w kierunku 5’3’(czyli od głowy do ogona). U ssaków przeważa degradacja w kierunku 3’5’

13. W jaki sposób degradacja poli-A może wpływać na usuwanie czapeczki? OBSERWACJA 1 U mutantów drożdży, które nie mają białka Pab1p usunięcie czapeczki może nastąpić nawet, gdy nie zajdzie deadenylacja  to niepoli-A lecz kompleks Pab1p / poli-A chroni mRNA przed usunięciem czapeczki i degradacją !!! OBSERWACJA 2 kompleks Pab1p / poli-Astymuluje translację (efekt synergistyczny z czapeczką). Jak się to dzieje?

15. Historyjka - ciekawostka Pierwsze badania wykazały, że nie istnieje oddziaływanie pomiędzy PABP i eIF4G u ssaków. Natomiast u ssaków istnieje dodatkowe białko Paip1 (Poly-A Binding Protein Interacting Protein 1), które oddziałuje z PABP i może oddziaływać z eIF4A (helikaza). Craig AW, Haghighat A, Yu AT, Sonnenberg N,Interaction of polyadenylate-binding protein with the eIF4G homologue PAIP enhances translation.Nature. 1998

16. Historyjki ciag dalszy: Imataka H, Gradi A, Sonenberg N: A newly identified N-terminal amino acid sequence of human eIF4G binds poly(A)-binding protein and functions in poly(A)-dependent translation. EMBO J. 1998 Badania były prowadzone przed poznaniem ludzkiego genomu. Był wówczas sklonowany ludzki eIF4G bez „prawdziwego” N-końca.

17. FUNKCJA ODDZIAŁYWANIA KOŃCÓW • mRNA W STYMULACJI SZYBKOŚCI TRANSLACJI • Zapewnia preferencję translacji • niezdegradowanych mRNA bo: • Zwiększa prawdopodobieństwo • ponownego przyłączenia się rybosomu • do tego samego mRNA po zakończeniu • translacji • Może stanowić dodatkowy poziom • regulacji szybkości inicjacji translacji

18. Paip2 (jeśli przyłączą się 2 cząsteczki Paip2 do jednej cząsteczki PABP) hamuje oddziaływanie PABP z poli-A

19. Regulacja przez PABP/poli-A • Rozpatrując regulację translacji przez PABP należy pamiętać, że ogon poli-A może wiązać wiele cząsteczek PABP. • Jest to średnio 1 PABP na 25A; PABP nie może wiązać się do sekwencji krótszej niż 10-12 A. • Jest więc możliwe, że jedna cząsteczka PABP oddziałuje z eIF4G, a inna z Paip1. Ciekawostka: Wirus Polio oprócz proteazy 2A odpowiedzialnej za ograniczoną proteolizę eIF4G syntetyzuje też proteazę 3C zdolną do proteolizy PABP – podwójna strategia ograniczania translacji białek gospodarza Rotawirus produkuje białko NSP3, które wypiera PABP z eIF4G, i dodatkowo oddziałuje z 3’ końcem własnego, wirusowego RNA. Dochodzi do cyrkularyzacji wirusowego RNA.

20. Ciekawostka – regulacja translacji mRNA PABP

21. Klasycznym i specyficznymmechanizmem regulatorowym wykorzystującym elementy zlokalizowane w 3’UTR jest działanie mikroRNA (miRNA) • miRNA to małe niekodujące RNA (~21-22 n) • Wiele miRNA bierze udział w regulacji translacji mRNA zaangażowanych w procesy różnicowania. • miRNA są częściowo komplementarne do 3’UTR mRNA, których translację regulują. • W rejonach oddziaływania miRNA z mRNA budują się duże kompleksy białkowe (miRNP) o różnym składzie białek determinujące los mRNA

22. Historia: 1993 - Pierwszym poznanym miRNA był lin-4 (Caenorhabditis elegans). Badano mutacje, które prowadzą do nieprawidłowości w różnicowaniu i rozwoju nicienia. Stwierdzono, że mutacja występuje w obszarze, który nie koduje żadnego białka. Ale ten fragment DNA koduje jakieś RNA. Takie same defekty rozwojowe dawała mutacja w obrębie 3’UTR mRNA kodującego białko lin-14. Okazało się, że lin-4 RNA zawiera sekwencję komplementarną do kilku sekwencji w 3’UTR lin-14

23. Oddziaływanie lin-4 (miRNA) z 3’UTR mRNA lin-14 RISC – RNA-induced silencing complex MicroRNAs: small RNAs with a big role in gene regulation. Lin He & Gregory J. Hannon, Nature Reviews Genetics 5, 522-531 (July 2004)

24. The Nobel Prize in Physiology or Medicine 2006 "for their discovery of RNA interference - gene silencing by double-stranded RNA" Andrew Z. Fire Craig C. Mello University of Massachusetts Medical School Worcester, MA, USA Stanford University School of Medicine Stanford, CA, USA

25. Obecnie uważa się, że ponad 30% transkryptów w komórkach ludzkich jest regulowana przez miRNA. miRNAs znaleziono także w prostych organizmach wielokomórkowych jak: gąbki czy jamochłony. Dane na temat wszystkich poznanych miRNA można znaleźć w bazie danych: http://microrna.sanger.ac.uk

26. Różne miRNA oddziałują z 3’UTR różnych mRNA • Transkrypcja miRNA (pri-miRNA) podlega tekiej samej regulacji jak transkrypcja różnych mRNA • Ekspresja wielu miRNA jest specyficzna tkankowo • Zmiana ekspresji wielu miRNA jest obserwowana w nowotworach.

28. Ok. 50% loci miRNA ssaków leży blisko loci innych miRNA. Ulegają one wówczas transkrypcji jako policistronowa jednostka transkrypcyjna. Inne miRNA mają własne, odrębne promotory. Niektóre loci miRNA znajdują się w regionach niekodujących, inne w intronach (ok. 40%) lub w obszarach, które mogą być intronami lub egzonami w zależności od alternatywnego splajsingu.

29. RISC – RNA induced silencing complex

30. Która nić stanowi miRNA?

31. Jak działają miRNA: • Degradacja • Zahamowanie translacji • (na podstawie różnych badań proponowane • są różne hipotezy dotyczące mechanizmów • hamowania translacji) • zahamowanie oddziaływania eIF4E z czapeczką • zahamowanie oddziaływania eIF4E z eIF4G • zahamowanie przyłączenia dużej podjednostki rybosomu podczas inicjacji • odłączenie rybosomów od mRNA miRNA nie działają samodzielnie; działają kompleksy białkowe związane z miRNA (miRNP).

32. W skład kompleksu RISC (RNA-induced silencing complex) może wchodzić wiele różnych białek. AGO – białka argonautowe (ang. Argonauts) U człowieka 4 białka AGO (1, 2, 3, 4). Inna nazwa eIF2C (i też 1, 2, 3, 4). Tylko AGO2 ma aktywnośc endonukleazy i określana jest jako SLICER Inne białko tego kompleksu to białko GW182 (jest głównym białkiem ciałek P (P-bodies, processing bodies) W ogromnej większości przypadków oddziaływanie miRNA z mRNA ogranicza ekspresję białka. Są jednak znane przypadki, że w pewnych warunkach może stymulować translację białka

33. siRNA jest charakterystyczne tylko dla niektórych organizmów: np. muszki owocowej i roślin. Degradacja RNA z wykorzystaniem siRNA służy walce z wirusami U C. elegans i u ssaków nie występuje siRNA. Zarówno C. elegans jak i ssaki mają tylko jeden enzym Dicer Muszka ma 2 enzymy – jeden jest wykorzystywany do tworzenia siRNA, drugi do tworzenia miRNA. A. thaliana – 4 enzymy Dicer, 10 białek Ago

34. Różnice pomiędzy miRNA a siRNA miRNA – endogenne; siRNA – egzogenne (wirusowe) miRNA – prekursorem jest 70-80-nukleotydowa pętla RNA, siRNA - prekursorem jest długie, dsRNA miRNA – na ogół brak idealnej komplementarności; siRNA – idealna komplementarność

35. Ryboprzełączniki (ang.Riboswitches) Struktury mRNA regulujące transkrypcję lub translację. Występują w 5’ lub 3’ UTR Ich struktura zależy od wiązania drobnocząsteczkowego ligandu (niektóre aminokwasy, niektóre nukleotydy, niektóre koenzymy) lub warunków środowiska. Regulacja transkrypcji – w zależności od obecności ligandu – dochodzi (lub nie) do przedwczesnej terminacji transkrypcji (np. operon tryptofanowy) Regulacja translacji – w zależności od obecności ligandu lub w zależności od temperatury – sekwencja Shine-Dalgarno i kodon AUG są lub nie są dostępne dla startu translacji.

37. Ryboprzełączniki (ang.Riboswitches) Struktury mRNA regulujące transkrypcję lub translację. Występują w 5’ lub 3’ UTR Ich struktura zależy od wiązania drobnocząsteczkowego ligandu (niektóre aminokwasy, niektóre nukleotydy, niektóre koenzymy) lub warunków środowiska. Regulacja transkrypcji – w zależności od obecności ligandu – dochodzi (lub nie) do przedwczesnej terminacji transkrypcji (np. operon tryptofanowy; atenuacja). Regulacja translacji – w zależności od obecności ligandu lub w zależności od temperatury – sekwencja Shine-Dalgarno i kodon AUG są lub nie są dostępne dla startu translacji.

38. Przykłady: 1. Biosynteza lizyny u bakterii gram-ujemnych. mRNA enzymów zaangażowanych w syntezę lizyny posiadają strukturę, w skład której wchodzi sekwencja Shine-Dalgarno i AUG. Struktura ta jest stabilizowana przez lizynę. BRAK LIZYNY  BRAK STRUKTURY  Sekwencja S-D dostępna  zachodzi translacja

39. 2. Termosensory – struktury występujące 5’UTR mRNA niektórych białek (np.czynnika transkrypcyjnego 32). Wystepują u wielu różnych bakterii: S. typhimurium, E. coli, Y.pestis i in. W temp. 30C – struktura obejmująca sekwencję S-D i AUG. W temp. 37C – struktura topnieje. Dlaczego ryboprzełączniki nie funkcjonują u eukariotów?