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Aspects th oriques de la s paration chromatographique

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Aspects th oriques de la s paration chromatographique

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    1. Aspects thoriques de la sparation chromatographique Anne Mortier

    2. Chromatographie Place dans les laboratoires La chromatographie a pris une place considrable dans les laboratoires danalyse depuis son invention il y a juste 100 ans . En terme de chiffre daffaire mondial , la chromatographie reprsentait , en 2003, 41 % du march de linstrumentation danalyse molculaire.La chromatographie a pris une place considrable dans les laboratoires danalyse depuis son invention il y a juste 100 ans . En terme de chiffre daffaire mondial , la chromatographie reprsentait , en 2003, 41 % du march de linstrumentation danalyse molculaire.

    3. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    4. Chromatographie Historique 1906 : un chimiste russe, Mikhail Tswett, spare des pigments vgtaux colors sur une colonne remplie de carbonate de calcium pulvrulent, les pigments sont entrans avec de l'ther de ptrole 1940 : Martin et Synge dveloppent la pratique et la thorie de la chromatographie, ils obtiennent le prix Nobel en 1952 1952: mise au point de la Chromatographie en Phase Gazeuse (CPG) 1968 : mise au point de la Chromatographie Liquide Haute Performance CLHP ou HPLC en anglais 1979 : premire sparation chirale par HPLC Il y a 100 ans et quelques mois, un chimiste russe dcouvrait la chromatographie en purifiant des pigments vgtaux colors sur une colonne remplie de craieIl y a 100 ans et quelques mois, un chimiste russe dcouvrait la chromatographie en purifiant des pigments vgtaux colors sur une colonne remplie de craie

    5. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    6. Quest-ce que la chromatographie? Cette figure montre comment deux espces A et B se sparent dans une colonne par le processus dlution. Un chantillon contenant les 2 composs est introduit en tte de colonne.Lavance graduelle du solvant, ajout au sommet de la colonne, entrane les soluts vers le bas de la colonne en une suite continue de transferts entre les deux phases, la PS tasse dans la colonne et la PM ou luant qui la traverse.La vitesse de progression des deux composs dpend du temps quils passent chacun dans la PS et dans la PM.Les diffrences de vitesse rsultantes amnent la sparation des constituants du mlange sous forme de bandes tout au long de la colonne , bandes qui sortent individuellement en faisant passer un volume suffisant de PM dans cette colonne. Cette figure montre comment deux espces A et B se sparent dans une colonne par le processus dlution. Un chantillon contenant les 2 composs est introduit en tte de colonne.Lavance graduelle du solvant, ajout au sommet de la colonne, entrane les soluts vers le bas de la colonne en une suite continue de transferts entre les deux phases, la PS tasse dans la colonne et la PM ou luant qui la traverse.La vitesse de progression des deux composs dpend du temps quils passent chacun dans la PS et dans la PM.Les diffrences de vitesse rsultantes amnent la sparation des constituants du mlange sous forme de bandes tout au long de la colonne , bandes qui sortent individuellement en faisant passer un volume suffisant de PM dans cette colonne.

    7. Chromatographie dfinition Mthode de sparation des constituants dun mlange reposant sur les quilibres de concentration qui apparaissent lorsquun compos est mis en prsence de deux phases non miscibles La chromatographie est une technique de sparation des constituants d'un mlange base sur les interactions entre trois partenaires lors d'un processus dynamique : le composant (produit contenu dans le mlange), la phase mobile (lluant) la phase stationnaire Elle repose sur les quilibres.... La chromatographie est une technique de sparation des constituants d'un mlange base sur les interactions entre trois partenaires lors d'un processus dynamique : le composant (produit contenu dans le mlange), la phase mobile (lluant) la phase stationnaire Elle repose sur les quilibres....

    8. Chromatographie Aspects gnraux Phase stationnaire (PS) : immobilise dans une colonne ou fixe sur un support plan(ccm) Phase mobile (PM) : se dplaant au contact de la premire Elution : processus par lequel un compos est entran par le mouvement de la phase mobile travers la phase stationnaire

    9. Chromatographie Aspects gnraux Vitesse de la PM dans la colonne exprime : en dbit,D : volume de solvant traversant la colonne par unit de temps (mL/min) en vitesse linaire,u : distance parcourue dans la colonne par unit de temps (cm/min)

    10. Chromatographie Aspects gnraux chromatogramme

    11. Chromatographie Aspects gnraux Chromatogramme : trac des variations de composition de la phase lue au cours du temps Si , en bout de colonne, on place un dtecteur qui rpond la concentration du solut,on obtient un graphique dune fonction de la concentration en solut en fonction du temps.cest le chromatogramme.Si , en bout de colonne, on place un dtecteur qui rpond la concentration du solut,on obtient un graphique dune fonction de la concentration en solut en fonction du temps.cest le chromatogramme.

    12. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    13. Chromatographie classification Selon le phnomne physique responsable des changes entre PS et PM : adsorption partage change dions exclusion affinit Selon le nature physique de la phase mobile : liquide gaz Selon lobjectif vis : chromatographie analytique chromatographie prparative Nous nenvisagerons ici que la chromatographie sur colonne; On peut classer les diffrentes chromatographies selon le type dinteraction avec la PS et la PM, selon le type dquilibre( ces interactions seront abordes dans le deuxime expos); selon la nature de la PM, liquide ou gazeuse, et enfin selon lobjectif poursuivi, chromatographie analytique ou chromatographie prparative. La chromatographie analytique constitue le thme de ces deux journes. Nous nenvisagerons ici que la chromatographie sur colonne; On peut classer les diffrentes chromatographies selon le type dinteraction avec la PS et la PM, selon le type dquilibre( ces interactions seront abordes dans le deuxime expos); selon la nature de la PM, liquide ou gazeuse, et enfin selon lobjectif poursuivi, chromatographie analytique ou chromatographie prparative. La chromatographie analytique constitue le thme de ces deux journes.

    14. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    15. Chromatographie Appareillage

    16. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    17. Chromatographie grandeurs de rtention Temps de rtention Volume de rtention Coefficient de distribution Facteur de rtention

    18. Chromatographie grandeurs de rtention Temps de rtention: tR temps coul entre linstant de linjection et celui qui correspond sur le chromatogramme au maximum du pic qui lui est li

    19. Chromatographie grandeurs de rtention Temps de rtention rduit : tR tR= tR tM tM ou t0 : temps mort : temps ncessaire pour quun compos non retenu traverse la colonne Le temps de rtention rduit est le temps de rtention diminu du temps mort, ad du temps ncessaire pour quune espce non retenue traverse la colonne .Lchantillon contient souvent une telle espce non retenue. Pour mesurer ce temps mort , on peut utiliser luracile sur une C 18 en HPLC, de lair ou du mthane en GCLe temps de rtention rduit est le temps de rtention diminu du temps mort, ad du temps ncessaire pour quune espce non retenue traverse la colonne .Lchantillon contient souvent une telle espce non retenue. Pour mesurer ce temps mort , on peut utiliser luracile sur une C 18 en HPLC, de lair ou du mthane en GC

    20. Chromatographie grandeurs de rtention Volume de rtention VR ou volume dlution : Volume de phase mobile ncessaire pour faire migrer un compos dun bout lautre de la colonne VR = tR . D D : dbit de la phase mobile (constant)

    21. Chromatographie grandeurs de rtention Coefficient de distribution: KA rtention APM APS lution KA rapport entre la concentration du compos dans la phase stationnaire et la concentration du compos dans la phase mobile traduit limportance relative des forces intermolculaires qui existent entre le compos et les 2 phases Toutes les sparations chromatographiques sont bases sur les diffrences de rpartition du solut entre la PS et la PM. Cette quilibre est dcrit par cette quation , caractrise par une constante dquilibre gale au rapport de la conc. du compos dans la PS sa conc. dans la phase mobile. On parle aussi de rapport de distribution.Toutes les sparations chromatographiques sont bases sur les diffrences de rpartition du solut entre la PS et la PM. Cette quilibre est dcrit par cette quation , caractrise par une constante dquilibre gale au rapport de la conc. du compos dans la PS sa conc. dans la phase mobile. On parle aussi de rapport de distribution.

    22. Chromatographie grandeurs de rtention Facteur de rtention k ou k (ou de capacit) : Rend compte de la facult plus ou moins grande de la colonne retenir un compos Indpendant du dbit de la PM et des dimensions de la colonne k est accessible partir du chromatogramme Le facteur de rtention ou facteur de capacit, not k, est un paramtre exprimental important qui traduit laffinit dun compos pour la PS dans un systme chromatographique.Cest le rapport entre le temps de rtention rduit et le temps mort; il est indpendant du dbit de la PM et des dimensions de la colonne et est accessible partir du chromatogramme. Le facteur de rtention ou facteur de capacit, not k, est un paramtre exprimental important qui traduit laffinit dun compos pour la PS dans un systme chromatographique.Cest le rapport entre le temps de rtention rduit et le temps mort; il est indpendant du dbit de la PM et des dimensions de la colonne et est accessible partir du chromatogramme.

    23. Chromatographie grandeurs de rtention tR = tM + tR Si compos non retenu par la PS : tR = tM= tPM : temps pass dans la PM ? tR= tPS: temps pass dans la PS si mT = mPM + mPS k est indpendant de mT Etant donn que le temps de rtention est une somme du temps mort et du temps de rduit et que pour un compos non retenue par la PS, le temps de rtention vaut le temps mort, d le temps pass dans la PM, et dans ce cas, le temps de rtention rduit est aussi le temps pass dans la PS. Le facteur de rtention correspond ds lors au rapport du temps pass par un compos dans la PS celui pass dans la PM; Si une masse totale mt a t introduite dans la colonne (celle-ci se rpartit en une masse mM prsente dans la phase mobile et en une masse mS prsente dans la PS.) Alors, les masses prsentes dans chacune des phases sont proportionnelles aux temps passs dans chacune des phases. On trouve enfin que la facteur de rtention dun compos est le produit de son coefficient de distribution multipli par le rapport des volumes de PS et de PM respectivement. k est indpendant de la masse dchantillon introduite dans le systme chromatographique.Etant donn que le temps de rtention est une somme du temps mort et du temps de rduit et que pour un compos non retenue par la PS, le temps de rtention vaut le temps mort, d le temps pass dans la PM, et dans ce cas, le temps de rtention rduit est aussi le temps pass dans la PS. Le facteur de rtention correspond ds lors au rapport du temps pass par un compos dans la PS celui pass dans la PM; Si une masse totale mt a t introduite dans la colonne (celle-ci se rpartit en une masse mM prsente dans la phase mobile et en une masse mS prsente dans la PS.) Alors, les masses prsentes dans chacune des phases sont proportionnelles aux temps passs dans chacune des phases. On trouve enfin que la facteur de rtention dun compos est le produit de son coefficient de distribution multipli par le rapport des volumes de PS et de PM respectivement. k est indpendant de la masse dchantillon introduite dans le systme chromatographique.

    24. Chromatographie grandeurs de rtention En chromatographie capillaire ( GC) : est trs lev ? tR rduits on peut prvoir le comportement des colonnes grce ce facteur : pour un compos et une PS donns, k diminue quand augmente

    25. Chromatographie grandeurs de rtention Facteur de rtention k et tR : tR = tM ( 1 + k ) tR = tM( 1 + K / ) ? permet de calculer le coefficient de distribution En pratique, k ne peut pas dpasser 10 k < 1: le compos sort trop tt k 2-5 : correct On peut aussi tablir le lien entre la valeur de k et le temps de rtention. Cette nouvelle relation permet de calculer le coefficient de distribution puisque la valeur de beta est accessible partir des caractristiques physiques de la colonne ( diamtre, paisseur du film liquide dpos, longueur) En pratique, on veillera garder des valeurs de k infrieur 10 pour avoir une dure danalyse raisonnable; Des valeurs comprises entre 2 et 5 sont des valeurs correctes.On peut aussi tablir le lien entre la valeur de k et le temps de rtention. Cette nouvelle relation permet de calculer le coefficient de distribution puisque la valeur de beta est accessible partir des caractristiques physiques de la colonne ( diamtre, paisseur du film liquide dpos, longueur) En pratique, on veillera garder des valeurs de k infrieur 10 pour avoir une dure danalyse raisonnable; Des valeurs comprises entre 2 et 5 sont des valeurs correctes.

    26. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    27. Chromatographie Facteur de sparation ou de slectivit a permet de prciser les positions relatives de deux pics sur un chromatogramme : a est toujours suprieur 1 a est laptitude dun systme chromatographique sparer deux composs A partir de ces grandeurs de rtention, on peut dfinir le facteur de sparation alpha ( iupac) ou facteur de slectivit qui permet de prciser les positions relatives de deux pics sur un chromatogramme. Ce facteur de sparation est le rapport du coefficient de distribution du compos le plus retenu celui du composle moins retenu. Il vaut aussi le rapport des facteur de rtention k de ces deux composs et est accessible sur le chromatogramme partir des temps de rtention rduits. Une valeur de alpha suprieure lunit est la condition pour avoir une sparation de 2 composs par chromatographie. alpha reprsente la slectivit d laptitude dun systme chromatographique sparer deux composs. Plus la valeur de alpha est grande, plus les pics des composs en question sont loigns lun de lautre.A partir de ces grandeurs de rtention, on peut dfinir le facteur de sparation alpha ( iupac) ou facteur de slectivit qui permet de prciser les positions relatives de deux pics sur un chromatogramme. Ce facteur de sparation est le rapport du coefficient de distribution du compos le plus retenu celui du composle moins retenu. Il vaut aussi le rapport des facteur de rtention k de ces deux composs et est accessible sur le chromatogramme partir des temps de rtention rduits. Une valeur de alpha suprieure lunit est la condition pour avoir une sparation de 2 composs par chromatographie. alpha reprsente la slectivit d laptitude dun systme chromatographique sparer deux composs. Plus la valeur de alpha est grande, plus les pics des composs en question sont loigns lun de lautre.

    28. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    29. Modle des plateaux dplacement du solut dans la colonne en une suite dtapes distinctes chaque tape: APM APS colonne de chromatographie = srie de compartiments distincts ou plateaux thoriques dans lesquels stablit lquilibre de rpartition du solut chromatographie = suite de temps dquilibration suivis de glissements de la PM dun plateau par rapport la PS Diffrentes thories ont t avances pour modliser la chromatographie. Lune de ces thories, le modle des plateaux (de Craig), considre que chaque solut se dplace progressivement dans la colonne en une suite dtapes distinctes. A chacune de ces tapes, la concentration du solut dans la PM est en quilibre avec la concentration du solut dans la PS. On peut alors imaginer la colonne de chromatographie comme une srie de compartiments distincts dans lesquels stablit lquilibre de rpartition du solut. Ces compartiments imaginaires sont ce quon appelle les plateaux thoriques. A chaque nouvel quilibre , le solut a progress dun petit disque supplmentaire dans la colonne. La chromatographie est dcrite comme une suite de temps dquilibration suivis de glissements de la PM dun plateau par rapport la PS. Diffrentes thories ont t avances pour modliser la chromatographie. Lune de ces thories, le modle des plateaux (de Craig), considre que chaque solut se dplace progressivement dans la colonne en une suite dtapes distinctes. A chacune de ces tapes, la concentration du solut dans la PM est en quilibre avec la concentration du solut dans la PS. On peut alors imaginer la colonne de chromatographie comme une srie de compartiments distincts dans lesquels stablit lquilibre de rpartition du solut. Ces compartiments imaginaires sont ce quon appelle les plateaux thoriques. A chaque nouvel quilibre , le solut a progress dun petit disque supplmentaire dans la colonne. La chromatographie est dcrite comme une suite de temps dquilibration suivis de glissements de la PM dun plateau par rapport la PS.

    30. Modle des plateaux pics dlution gaussien Un solut se dplaant dans une colonne donne un signal dallure gaussienne au moment de sa sortie au niveau du dtecteur ? : cart-type w1/2 ou ? = 2.35 ? : largeur mi-hauteur w ou wb : largeur la base = 4 ? Ce modle permet de montrer que le solut se rpartit dans les plateaux successifs selon une courbe de gauss et quun solut se dplaant dans la colonne donne un pic dallure gaussienne au moment de sa sortie au niveau du dtecteur. Le pic est ds lors caractris par un cart-type s plus ou moins grand selon ltalement du pic. La largeur mi-hauteur symbolise par w 1/2 ou delta ,vaut 2.35 s.Ce modle permet de montrer que le solut se rpartit dans les plateaux successifs selon une courbe de gauss et quun solut se dplaant dans la colonne donne un pic dallure gaussienne au moment de sa sortie au niveau du dtecteur. Le pic est ds lors caractris par un cart-type s plus ou moins grand selon ltalement du pic. La largeur mi-hauteur symbolise par w 1/2 ou delta ,vaut 2.35 s.

    31. Modle des plateaux La colonne de longueur L est dcoupe en N petits disques fictifs ou plateaux thoriques de mme hauteur H : N = nombre de plateaux thoriques L en cm ? H en cm La longueur de la colonne, L, est ainsi dcoupe en N petits disques ou plateaux thoriques de mme hauteur H. Dans chacun deux stablit lquilibre de rpartition du solut entre PS et PM. N est le nombre de plateaux thoriques de hauteur H. La hauteur dun plateau thorique se mesure en cm. La longueur de la colonne, L, est ainsi dcoupe en N petits disques ou plateaux thoriques de mme hauteur H. Dans chacun deux stablit lquilibre de rpartition du solut entre PS et PM. N est le nombre de plateaux thoriques de hauteur H. La hauteur dun plateau thorique se mesure en cm.

    32. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    33. ?l2 = H. l H : coefficient de proportionnalit entre la variance de la bande et la longueur parcourue H : HEPT = hauteur quivalente un plateau thorique l : longueur parcourue Efficacit dune colonne Dfinition de H Plus le temps de sjour dans la colonne augmente, plus le pic staleprincipalement cause du phnomne de diffusion La dispersion linaire sl crot avec la longueur parcourue et la variance de la bande est proportionnelle la longueur parcourue dans la colonne H est le coefficient de proportionnalit entre la variance de la bande et la longueur parcourue. La hauteur de plateau est aussi appele hauteur quivalente dun plateau thorique. Plus H est faible, plus la dispersion est faible,plus ltalement de la bande est rduit, plus le pic est troit. Plus le temps de sjour dans la colonne augmente, plus le pic staleprincipalement cause du phnomne de diffusion La dispersion linaire sl crot avec la longueur parcourue et la variance de la bande est proportionnelle la longueur parcourue dans la colonne H est le coefficient de proportionnalit entre la variance de la bande et la longueur parcourue. La hauteur de plateau est aussi appele hauteur quivalente dun plateau thorique. Plus H est faible, plus la dispersion est faible,plus ltalement de la bande est rduit, plus le pic est troit.

    34. Efficacit dune colonne Dfinition de H s2 en cm2 l en cm ? H en cm Valeurs de H: 0.1 1 mm en GC ~ 10 m en HPLC On retrouve la mme dimension en cm pour H que celle tablie par la thorie des plateaux. Les valeurs usuelles de H sont de 1/10me 1 mm en GC Elles atteignent 10 microns en HPLC On retrouve la mme dimension en cm pour H que celle tablie par la thorie des plateaux. Les valeurs usuelles de H sont de 1/10me 1 mm en GC Elles atteignent 10 microns en HPLC

    35. Efficacit dune colonne Pour une colonne de longueur L, le nombre de plateaux thoriques vaut le rapport de la longueur L de la colonne sur la hauteur dun plateau. H est aussi le coefficient de proportionnalit de la variance de la bande en fonction de la longueur parcourue lorsque cette longueur est la longueur totale de la colonne On peut valuer N en mesurant Tr et lcart-type du pic chromatographique puisque ces 2 paramtres sont dans le mme rapport que L et sigma L. Pour une colonne de longueur L, le nombre de plateaux thoriques vaut le rapport de la longueur L de la colonne sur la hauteur dun plateau. H est aussi le coefficient de proportionnalit de la variance de la bande en fonction de la longueur parcourue lorsque cette longueur est la longueur totale de la colonne On peut valuer N en mesurant Tr et lcart-type du pic chromatographique puisque ces 2 paramtres sont dans le mme rapport que L et sigma L.

    36. Efficacit dune colonne valuation quantitative N = mesure de lefficacit dune colonne si H ?? largeur de bande ? ? sparation ? Car s=Wb/4 N est mesurable sur un chromatogramme Si N est constant, la largeur dun pic chromatographique augmente quand le temps de rtention augmente N , le nombre de plateaux thoriques, permet dvaluer quantitativement lefficacit dune colonne. Lefficacit dune colonne sparer des constituants est amliore quand la hauteur dun plateau thorique diminue. N est mesurable sur un chromatogramme On prfrera mesurer la largeur la base du pic ,w, valant 4 s ou encore, mesurer la largeur mi-hauteur, w1/2 ( cause des frquentes dformations la base du pic) On notera qu efficacit gale, pour une colonne donne, la largeur dun pic chromatographique augmente lorsque le temps de sjour dans la colonne augmente.N , le nombre de plateaux thoriques, permet dvaluer quantitativement lefficacit dune colonne. Lefficacit dune colonne sparer des constituants est amliore quand la hauteur dun plateau thorique diminue. N est mesurable sur un chromatogramme On prfrera mesurer la largeur la base du pic ,w, valant 4 s ou encore, mesurer la largeur mi-hauteur, w1/2 ( cause des frquentes dformations la base du pic) On notera qu efficacit gale, pour une colonne donne, la largeur dun pic chromatographique augmente lorsque le temps de sjour dans la colonne augmente.

    37. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    38. Thorie de llargissement des bandes influence de la vitesse dcoulement de la phase mobile la variance du pic (?2) est proportionnelle H : quand H diminue, la largeur du pic diminue quation de van Deemter : H = A + B/ u + C. u u = vitesse linaire dcoulement de la phase mobile A, B, C : constantes pour une colonne donne et une PS donne La variance du pic chromatographique est proportionnelle H et quand H diminue, la largeur diminue. Dans ce que nous avons vu prcdemment, la vitesse de la PM na pas encore t prise en compte dans les diffrentes expressions caractrisant lefficacit de la sparation. Linfluence de la vitesse de la PM a t mise en vidence par des chimistes hollandais ( Van Deemter et al. 1950) . Ils ont pu montrer que vers les faibles dbits, H augmentait asymptotiquement tandis que vers des dbits plus levs, H augmentait linairement. Cest la courbe exprimentale tablie pour une colonne de GC remplie. Lquation de van Deemter donne une interprtation mathmatique de la courbe. H (HEPT) est une somme de trois termes , A , B/u, C,u, ayant chacun une signification physique prcise . Cette quation montre quil existe une dbit optimal pour chaque colonne, correspondant au minimum de H, comme le prvoit la courbe reprsentant lquation. Les 3 coefficients A,B et C sont relis des paramtres physico-chimiques, la colonne et aux conditions opratoires. La variance du pic chromatographique est proportionnelle H et quand H diminue, la largeur diminue. Dans ce que nous avons vu prcdemment, la vitesse de la PM na pas encore t prise en compte dans les diffrentes expressions caractrisant lefficacit de la sparation. Linfluence de la vitesse de la PM a t mise en vidence par des chimistes hollandais ( Van Deemter et al. 1950) . Ils ont pu montrer que vers les faibles dbits, H augmentait asymptotiquement tandis que vers des dbits plus levs, H augmentait linairement. Cest la courbe exprimentale tablie pour une colonne de GC remplie. Lquation de van Deemter donne une interprtation mathmatique de la courbe. H (HEPT) est une somme de trois termes , A , B/u, C,u, ayant chacun une signification physique prcise . Cette quation montre quil existe une dbit optimal pour chaque colonne, correspondant au minimum de H, comme le prvoit la courbe reprsentant lquation. Les 3 coefficients A,B et C sont relis des paramtres physico-chimiques, la colonne et aux conditions opratoires.

    39. Thorie de llargissement des bandes Equation de van Deemter A: diffusion turbulente ou diffusion de Eddy : terme d aux multiples veines dcoulement : A= ?.dp ? : facteur de remplissage de la colonne dp : diamtre des grains Le terme A , appel diffusion turbulente ou diffusion dEddy, est reli au profil dcoulement de la PM travers la PS. La taille des particules, leur rpartition et la rgularit du remplissage de la colonne sont lorigine de chemins prfrentiels de la PM et donc du solut quelle transporte, chemins ou trajectoires qui ont des longueurs diffrentes. Ce phnomne contribue largir le pic chromatographique comme on peut limaginer par le schma qui suit.Le terme A , appel diffusion turbulente ou diffusion dEddy, est reli au profil dcoulement de la PM travers la PS. La taille des particules, leur rpartition et la rgularit du remplissage de la colonne sont lorigine de chemins prfrentiels de la PM et donc du solut quelle transporte, chemins ou trajectoires qui ont des longueurs diffrentes. Ce phnomne contribue largir le pic chromatographique comme on peut limaginer par le schma qui suit.

    40. Thorie de llargissement des bandes Equation de van Deemter Diffusion de Eddy Une phase stationnaire de granulomtrie fine et rgulire diminue le terme A.Une phase stationnaire de granulomtrie fine et rgulire diminue le terme A.

    41. Thorie de llargissement des bandes Equation de van Deemter Colonne pleine : A ? 0 Colonne capillaire(G.C.) : A = 0 ? Equation de Golay pour la GC en colonne capillaire : Ce terme A est absent par nature dans les colonnes capillaires car il ny a pas de remplissage de la colonne. Lquation sans terme A est lquation de Golay et la courbe coorespondante montre labaissement de la courbe conscutif la supression du terme A.Ce terme A est absent par nature dans les colonnes capillaires car il ny a pas de remplissage de la colonne. Lquation sans terme A est lquation de Golay et la courbe coorespondante montre labaissement de la courbe conscutif la supression du terme A.

    42. Thorie de llargissement des bandes Equation de van Deemter B/u : diffusion longitudinale : diffusion du compos de la rgion concentre dune bande vers la rgion dilue ? : facteur dobstruction ou de tortuosit DM : coefficient de diffusion : mesure la mobilit du compos dans la phase mobile plus faible dans les liquides que dans les gaz augmente avec la temprature diminue quand la viscosit du milieu augmente

    43. C.u : cintique de transfert de masse C. u = (CPS + CPM).u Transfert de masse favoris par : une faible paisseur de phase stationnaire un petit diamtre de colonne une temprature plus leve un coefficient de diffusion DM peu lev (PM peu visqueuse) un faible dbit dluant Thorie de llargissement des bandes Equation de van Deemter Le terme Cu est la cintique de transfert de masse ou cintique dchange entre PM et PS. On observe aussi un largissement des pics d aux effets de transfert de masse. Lquilibre entre PM et PS stablit lentement et la qualit de la sparation sera mauvaise si llution est trop rapide et les quilibres, incomplets ce qui se produit aux grandes valeurs de u Ce transfert de masse est ds lors favoris par de faibles paisseurs de PM et de PS, par un petit diamtre de colonne, par des coefficients de diffusion levs ( PM peu visqueuse ), par des dbits dluant faibles. On constate donc que la contribution de la vitesse dlution sur les termes B/u et C.u est contradictoire. La courbe exprimentale montre quil faut chercher un compromis entre deux phnomnes: la diffusion et la vitesse dchange entre les phases.Le terme Cu est la cintique de transfert de masse ou cintique dchange entre PM et PS. On observe aussi un largissement des pics d aux effets de transfert de masse. Lquilibre entre PM et PS stablit lentement et la qualit de la sparation sera mauvaise si llution est trop rapide et les quilibres, incomplets ce qui se produit aux grandes valeurs de u Ce transfert de masse est ds lors favoris par de faibles paisseurs de PM et de PS, par un petit diamtre de colonne, par des coefficients de diffusion levs ( PM peu visqueuse ), par des dbits dluant faibles. On constate donc que la contribution de la vitesse dlution sur les termes B/u et C.u est contradictoire. La courbe exprimentale montre quil faut chercher un compromis entre deux phnomnes: la diffusion et la vitesse dchange entre les phases.

    44. Thorie de llargissement des bandes Equation de van Deemter En HPLC : effet moins prononc de B/U trs faible dbit car DM beaucoup plus faible quen GC La contribution du terme C.u sur H dpend de la vitesse de lluant de manire plus complexe Voici la courbe de Van Deemter pour lHPLC/ On nobserve pas de remonte abrupte de la courbe du ct des trs faibles dbits car le coefficient Dm est beaucoup plus faible quen GC La contribution du terme C.u sur H dpend de la vitesse de lluant de manire plus complexe car la cintique de transfert de masse dans la Pm liquide est trs limiteVoici la courbe de Van Deemter pour lHPLC/ On nobserve pas de remonte abrupte de la courbe du ct des trs faibles dbits car le coefficient Dm est beaucoup plus faible quen GC La contribution du terme C.u sur H dpend de la vitesse de lluant de manire plus complexe car la cintique de transfert de masse dans la Pm liquide est trs limite

    45. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    46. Qualit dune sparation Deux facteurs contribuent une bonne sparation par chromatographie : la diffrence entre les temps de rtention la largeur des pics Examinons prsent les conditions pour avoir une bonne sparation de deux pics chromatographiques. On le voit sur le schma, une sparation efficace require une diffrence suffisante entre les tr et une largeur de pic restreinte.Examinons prsent les conditions pour avoir une bonne sparation de deux pics chromatographiques. On le voit sur le schma, une sparation efficace require une diffrence suffisante entre les tr et une largeur de pic restreinte.

    47. Rsolution La rsolution est la qualit de sparation de deux pics voisins. Pour deux molcules A et B : W b = 4 ? Ceci nous amne dfinir la rsolution qui est le degr de sparation de deux pics voisins ou la qualit de sparation de deux pis voisins. Elle est mesure par la diffrence des tr rapporte la moyenne arithmtique des largeurs la base des picsCeci nous amne dfinir la rsolution qui est le degr de sparation de deux pics voisins ou la qualit de sparation de deux pis voisins. Elle est mesure par la diffrence des tr rapporte la moyenne arithmtique des largeurs la base des pics

    48. Rsolution Normalement, des pics voisins ont des ? pratiquement identiques. On trouve alors que: Comme des pics voisins ont vraisemblablement des largeurs identiques, la relation devient celle-ci.Comme des pics voisins ont vraisemblablement des largeurs identiques, la relation devient celle-ci.

    49. Rsolution RS = 1 si ?tR = 4s Une rsolution de 1.5 est ncessaire pour une analyse quantitative (? tR = 6s) Si la diffrence entre les tr est de 4 sigmas, la rsolution vaut 1. Pour une rsolution de 1, le taux de recouvrement du pic de A par le pic de B et vice-versa est de 2,25%( car la surface comprise entre tr - 2? et tr + 2? est de 95,5%). Une sparation analytique demande une rsolution de 1,5 d une diffrence de tr de 6 sigmas.Si la diffrence entre les tr est de 4 sigmas, la rsolution vaut 1. Pour une rsolution de 1, le taux de recouvrement du pic de A par le pic de B et vice-versa est de 2,25%( car la surface comprise entre tr - 2? et tr + 2? est de 95,5%). Une sparation analytique demande une rsolution de 1,5 d une diffrence de tr de 6 sigmas.

    50. Effet des facteurs de capacit et de slectivit sur la rsolution k= facteur de capacit moyen de deux composs Quand a tend vers 1 On tablit facilement la relation qui lie la rsolution dune colonne et le nombre de ses plateaux thoriques ainsi que les facteurs de rtention et de sparation de 2 composs.On tablit facilement la relation qui lie la rsolution dune colonne et le nombre de ses plateaux thoriques ainsi que les facteurs de rtention et de sparation de 2 composs.

    51. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? But : obtenir le degr de rsolution souhait en un minimum de temps augmenter N modifier k augmenter a L analyse de la courbe de Van Deemter nous a permis de voir comment amliorer les performances dune analyse chromatographique en agissant sur H. Lorsquon souhaite optimiser une analyse, la rsolution et le temps dlution sont les deux variables dpendantes les plus importantes optimiser; le but est de russir une sparation suffisante en un minimum de temps. En reprenant la formule de la rsolution, on constate quon peut lamliorer en agissant sur trois paramtres :lefficacit,le facteur de rtention et la slectivit. Rsumons les facteurs influenant favorablement ces trois paramtres , en gardant lesprit quil est toujours plus facile et moins hasardeux de modifier la physique que la chimie de la sparation.L analyse de la courbe de Van Deemter nous a permis de voir comment amliorer les performances dune analyse chromatographique en agissant sur H. Lorsquon souhaite optimiser une analyse, la rsolution et le temps dlution sont les deux variables dpendantes les plus importantes optimiser; le but est de russir une sparation suffisante en un minimum de temps. En reprenant la formule de la rsolution, on constate quon peut lamliorer en agissant sur trois paramtres :lefficacit,le facteur de rtention et la slectivit. Rsumons les facteurs influenant favorablement ces trois paramtres , en gardant lesprit quil est toujours plus facile et moins hasardeux de modifier la physique que la chimie de la sparation.

    52. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? But : obtenir le degr de rsolution souhait en un minimum de temps augmenter N : ? L : si L double, alors R augmente de v2 mais dure de sparation augmente ? H : ? particules support (?terme A ) ? colonne (? terme C) ?T(GC) (? terme B) ? paisseur du film liquide(GC) (? terme C) ? viscosit de la PM ( HPLC) (? terme C) optimiser u ( vitesse linaire de PM)

    53. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? modifier k: kB optimum: 1-5 viter kB >10 (dure dlution ! ) modifier la T (GC) modifier la composition de la PM (HPLC) diminuer lpaisseur du film liquide et augmenter le diamtre interne de la colonne (modification de ? en GC) augmenter a si proche de 1 (maintenir 1< k< 10) modifier la T de la colonne modifier la composition de la PS modifier la composition de la PM (HPLC) K suprieur 10 : augmentation de la dure dlution sans augmentation significative de la rsolution Les facteurs k et alpha sont troitement lis.K suprieur 10 : augmentation de la dure dlution sans augmentation significative de la rsolution Les facteurs k et alpha sont troitement lis.

    54. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? Modification de k en cours dlution : Par un gradient de composition ou programmation de solvant : augmentation graduelle ou continue de la puissance de lluant en cours dlution (HPLC) Modification de k, a et de H Amlioration de N et de R Par une programmation de temprature : augmentation graduelle ou continue de la temprature de la colonne en cours dlution (GC) Modification de k, a et de H Amlioration de N et de R Quand le mlange sparer est complexe et que les coefficients de distributions et les facteurs de rtention sont trs loigns, on modifie k au cours -mme de llution:par un gradient dlution en HPLC ou par une programmation de temprature en GC.Quand le mlange sparer est complexe et que les coefficients de distributions et les facteurs de rtention sont trs loigns, on modifie k au cours -mme de llution:par un gradient dlution en HPLC ou par une programmation de temprature en GC.

    55. Comment optimiser une analyse en chromatographie sur colonne ? Programmation de temprature en GC

    56. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    57. Comment rduire la diffusion hors colonne? Diffusion dans linjecteur Diffusion dans le dtecteur s2global= s2colonne+ s2injecteur + s2dtecteur Variance du pic due linjection ou la dtection : Solutions : ? minimiser les volumes morts (tubing) ? dtection sur colonne, injection sur colonne (G.C.) Nous avons vu les phnomnes de diffusion dans la colonne, phnomnes qui contribuent llargissement des pics. Mais une diffusion du solut a galement lieu en dehors de la colonne, dans linjecteur , dans le dtecteur et dans tous les lments de jonction entre les diffrentes parties du systme. La variance du pic due linjection ou la dtection est proportionnelle au carr du temps pass dans ces lments . Pour la rduire, il convient de minimiser tous les volumes morts en rduisant au maximum la longueur des tubulures . Une dtection sur colonne apporte lavantage de supprimer la diffusion dans le dtecteur.Nous avons vu les phnomnes de diffusion dans la colonne, phnomnes qui contribuent llargissement des pics. Mais une diffusion du solut a galement lieu en dehors de la colonne, dans linjecteur , dans le dtecteur et dans tous les lments de jonction entre les diffrentes parties du systme. La variance du pic due linjection ou la dtection est proportionnelle au carr du temps pass dans ces lments . Pour la rduire, il convient de minimiser tous les volumes morts en rduisant au maximum la longueur des tubulures . Une dtection sur colonne apporte lavantage de supprimer la diffusion dans le dtecteur.

    58. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    59. Pics asymtriques? pic gaussien ? K = CS/CM indpendant de la concentration en compos dans la colonne pic asymtrique si K varie avec la concentration en solut Les chromatogrammes rels sont quelquefois loin de prsenter des pics daspect gaussien. On ne peut observer un pic gaussien que si le coefficient de distribution est constant et indpendant de la concentration en solut dans la colonne. On observera une dformation du pic par rapport la courbe gaussienne quand ce coefficient de distribution varie avec la concentration dans la colonne. Les chromatogrammes rels sont quelquefois loin de prsenter des pics daspect gaussien. On ne peut observer un pic gaussien que si le coefficient de distribution est constant et indpendant de la concentration en solut dans la colonne. On observera une dformation du pic par rapport la courbe gaussienne quand ce coefficient de distribution varie avec la concentration dans la colonne.

    60. Pics asymtriques ? Fronting ou front diffus: la phase stationnaire est sature Tailing ou trane : de petites concentrations en solut sont davantage retenues que des plus grandes concentrations Un isotherme de distribution est le graphique de la variation de la conc. ds la phase stationnaire en fonction de la concentration dans la phase mobile. Si cet isotherme est convexe, on parle de front diffus ou fronting, indiquant que la phase stationnaire est sature en solut Si lisotherme est concave , on parle de trane ou tailing. De petites concentrations en solut sont davantage retenues que des plus grandes concentrations; ceci peut se produire lorsque des sites polaires du support de la PS ou de la paroi de la colonne en GC formant des liaisons avec les soluts polaires ( ex : diatomite, verre, silice). Un isotherme de distribution est le graphique de la variation de la conc. ds la phase stationnaire en fonction de la concentration dans la phase mobile. Si cet isotherme est convexe, on parle de front diffus ou fronting, indiquant que la phase stationnaire est sature en solut Si lisotherme est concave , on parle de trane ou tailing. De petites concentrations en solut sont davantage retenues que des plus grandes concentrations; ceci peut se produire lorsque des sites polaires du support de la PS ou de la paroi de la colonne en GC formant des liaisons avec les soluts polaires ( ex : diatomite, verre, silice).

    61. Pics asymtriques Lasymtrie dun pic est traduite par deux paramtres : le facteur de trane ou tailing factor (Ft ou TF) Lasymtrie dun pic est traduite par deux paramtres appels facteur de trane et facteur dasymtrie Le premier est le tailing factor (est souvent utilis dans lindustrie pharmaceutique). Il est mesur par le rapport AB sur AC , grandeurs mesures 5 % de la hauteur du pic.Lasymtrie dun pic est traduite par deux paramtres appels facteur de trane et facteur dasymtrie Le premier est le tailing factor (est souvent utilis dans lindustrie pharmaceutique). Il est mesur par le rapport AB sur AC , grandeurs mesures 5 % de la hauteur du pic.

    62. Pics asymtriques le facteur dasymtrie ou asymmetry factor (Fa ou As) Valeurs normales: entre 1.0 et 1.5 pour une nouvelle colonne Valeurs un peu plus leves dans des conditions relles Lasymmetry factor est plutt utilis dans lindustrie non pharmaceutique. Il est mesur par le rapport BC sur AB , grandeurs mesures 10 % de la hauteur du pic. Les grandeurs seront du mme ordre de grandeur mais seront rarement quivalentes. Les valeurs normales se situent entre 1 et 1.5 pour une nouvelle colonne et dans les conditions de test. Elles sont souvent lgrement suprieurs dans les conditions relles dutilisation dune colonne.Lasymmetry factor est plutt utilis dans lindustrie non pharmaceutique. Il est mesur par le rapport BC sur AB , grandeurs mesures 10 % de la hauteur du pic. Les grandeurs seront du mme ordre de grandeur mais seront rarement quivalentes. Les valeurs normales se situent entre 1 et 1.5 pour une nouvelle colonne et dans les conditions de test. Elles sont souvent lgrement suprieurs dans les conditions relles dutilisation dune colonne.

    63. Pics asymtriques ? Fronting ou front diffus: Ft <1 Fa<1 Tailing ou trane: Ft >1 Fa>1 Dans le cas dun fronting, ces 2 paramtres sont infrieurs lunit. Dans le cas dun tailing, les 2 paramtres sont suprieur lunit.Dans le cas dun fronting, ces 2 paramtres sont infrieurs lunit. Dans le cas dun tailing, les 2 paramtres sont suprieur lunit.

    64. Plan gnral Historique Dfinition Aspects gnraux Classification des chromatographies Appareillage Grandeurs de rtention Facteur de sparation Modle des plateaux Efficacit dune colonne Thorie de llargissement des pics (Van Deemter) Qualit dune sparation - Rsolution Diffusion hors colonne Pics asymtriques Dgradation dune colonne

    65. Dgradation dune colonne? Suivi de la performance dune colonne : Facteur de rtention dun standard (k) Nombre de plateaux (N) Asymtrie des pics

    66. En conclusion.... Efficacit dun chimiste analyste? En routine : Do things in the right way rendement, productivit, conomie augmenter le potentiel de lutilisateur et de linstrument En recherche : Do the right things rsolution de problmes analytiques complexes raction optimale et rapide de nouvelles situations Si vous travaillez en routine, le mot dordre est do the things in the right way, d quon attend de vous rendement,productivit et conomie. Ces deux journes vous permettront nous lesprons daugmenter votre potentiel dutilisateur ainsi que celui de linstrument! En recherche, le mot dordre est plutt do the right things d quon attend de vous la rsolution de problmes analytiques complexes. Dans ce cas,peut-tre vous aiderons-ns avoir encore une raction optimale et rapide face de nouvelles situations? Si vous travaillez en routine, le mot dordre est do the things in the right way, d quon attend de vous rendement,productivit et conomie. Ces deux journes vous permettront nous lesprons daugmenter votre potentiel dutilisateur ainsi que celui de linstrument! En recherche, le mot dordre est plutt do the right things d quon attend de vous la rsolution de problmes analytiques complexes. Dans ce cas,peut-tre vous aiderons-ns avoir encore une raction optimale et rapide face de nouvelles situations?

    67. Merci de votre attention! Rfrences utiles: " Principes d'analyse instrumentale" Skoog, Holler, Nieman, De Boeck 2003. "Quantitative Chemical Analysis", D.C. Harris, Freeman, 6th Edition, 2003. " Practical problem solving un HPLC" , S. Kromidas, WILEY-VCH, 2005