PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE V BOTANICE 2) Měření velikosti genomu rostlin Petr Koutecký, 201 2

1. PRŮTOKOVÁ CYTOMETRIE V BOTANICE 2) Měření velikosti genomu rostlin Petr Koutecký, 2012 Vytvořeno v rámci projektu Molekularizace biologických oborů PřF JU

2. Velikost genomu • různé definice, třeba pečlivě rozlišovat: • holoploidní velikost genomu • 1C hodnota – obsah DNA v 1 buňce, která má jeden „chromosome complement“ (sada chromozómů, která při pohlavním rozmnožování jde od jednoho rodiče) = má nchromosomů • u mechorostů (a někt. řas) dominatní fáze, gametofyt • u cévnatých kytek (a spousty živočichů) pouze gamety • 2C hodnota – u cévnatých kytek (aj. diplofazických organismů) obsah DNA v jedné somatické buňce, která právě neprochází buněčným dělením, tj. má 2n chromosomů • právě toto se většinou rozumí pod pojmem velikost genomu • analogicky 3C (např. endosperm), 4C, 8C,…

3. Velikost genomu • holoploidní velikost genomu = bez ohledu na skutečný ploidní stupeň • monoploidní velikost genomu – přepočet podle ploidie • 1Cx hodnota – obsah DNA jedné chromozómové sádky • haploid: 1Cx = 1C (n chromosomů; n = x) • diploid • u haplofazického organismu (např. mech)1Cx = ½ 1C (n chromosomů; n = 2x) • u diplofazického organismu (např. cévnatá kytka)1Cx = 1C, resp. ½ 2C (2n chromosomů; 2n = 2x) • tetraploid • u diplofazického organismu (např. cévnatá kytka)1Cx = ½ 1C, resp. ¼ 2C (2n chromosomů; 2n = 4x)

4. Velikost genomu • jednotky: • pg [pikogram] DNA (= jednotka hmotnosti) • Mbp nebo Gbp (= počet bazí) • 1 pg ~ 978 Mbp (1Mbp = 106 bp) • 1 pg ~ 0.978 Gbp (1Gbp = 109 bp) • 1 Gbp ~ 1.022 pg (= 1 / 0.978)

5. Fáze buněčného cyklu • před dělením se replikuje DNA = velikost genomu buňky se v průběhu buněčného cyklu mění • G1-, S-, G2, M-fáze • Jemnější dělení ještě na základě obsahu RNA • proto píšeme G1/G0 fáze (obsahem DNA se neliší) • Neplést s C-hodnotami: • např. u diploida cykluje buňkamezi 2C (G1-fáze) a 4C (G2-fáze) • u tetraploida 4C (G1-fáze) a 8C (G2-fáze) • neexistuje G4, G8,… -fáze ! Shapiro 2003

6. Velikost genomu + buněčný cyklus Jak to všechno spolu souvisí Odontitesvernus s.l.2 ploidie • diploid • tetraploid malá míra endopolyploidie Silná endopolyploideGymnocalycium (kaktus) 2C (2Cx) G1 – 2C-buňky G2 – 2C-buňky nebo G1 – 4C-buňky 4C (4Cx) standard 8C (8Cx) G2 – 4C-buňky G1 2C (4Cx) log scale 4C 8C 16C 2C standard 32C G2 4C (8Cx) standard 64C

7. Standardy & standardizace • cytometr nemá absolutní jednotky • měříme proto vždy relativně – porovnání vzorku s už dříve stanoveným standardem • chemické metody (kdysi) • izolace DNA z určitého kusu tkáně (známý počet buněk), kvantifikace, obsah na buňku • FCM, FD apod. • ty použily nějaký jiný standard • sekvenování genomů • uvědomit si, co měříme! rostlinné standardy 2C, vzorek různě (např. mechy 1C, cévnaté kytky 2C) • měření 1C × 2C nevadí, jen to správně přepočítat a uvádět

8. Standardy & standardizace Tři typy standardizace • externí – cytometr seřízen tak, aby standard byl v určité pozici, do vzorků se již nepřidává • poměr vzorek / standard počítán proti původní pozici standardu • předpoklad, že není náhodný posun mezi vzorky apod. (standard by vždy byl na „svém“ místě) • zanedbává vliv sekundárních metabolitů • v praxi použitelné pouze na odhad ploidií, nikdy na přesná měření velikosti genomu • největší zdroj chyb u starších prací (vnitrodruhová „variabilita“ velikost genomu apod.)

9. Standardy & standardizace Tři typy standardizace • interní – standard přidáván ke vzorku, zpracováván a měřen spolu s ním • ideální (jediný možný) postup pro přesné měření velikosti genomu • není ovlivněna náhodným posunem přístroje • malé (žádné?) ovlivnění sekundárními metabolity – všechna jádra (standard i vzorek) jsou ve stejném prostředí a tedy ovlivněna stejně • endogenní – zvláštní situace, kdy část jader slouží jako interní standard • studie endopolyplodie – 2C pík × ostatní • analýzy semen – embryo × endosperm

10. Standardy & standardizace Tři typy standardizace • pseudointerní – standard izolován zvlášť, přidán ke vzorku až před měřením a měřen spolu s ním • není vliv náhodného posunu přístroje • neodstraňuje vliv sekundárních metabolitů • pro přesná měření nepoužitelné • pozor! použití některých obvyklých fixovaných standardů je pseudointerní standardizace: • CRBC (chicken red blood cells) – fixované kuřecí červené krvinky,trout erythrocytes – fixované červené krvinky pstruha, apod. • může být problém i s různou dobou a podmínkami skladování (dvě různé sady CRBC nemusí dát stejné výsledky…)

11. Standardy & standardizace Požadavky na standard • biologický materiál, podobný vzorku • rostlinný standard pro rostliny, hmyzí pro hmyz,… • podobný typ tkáně a metabolický stav • podobný stav chromatinu (vliv na vazbu interkalačních barviv?) • bez (většího) obsahu sekundárních metabolitů • známý obsah DNA, ověřený více laboratořemi, atd. • přiměřeně blízká velikost genomu standardu a vzorku • velké rozpětí velikostí genomu, neexistuje univerzální standard • ne méně než ~20% (jinak překryv píků, nepřesný odečet) • ne více než 4-násobek (nelinearita měření) • (dostupnost standardu)

12. Standardy & standardizace • v naší laboratoři používaná sada standardů laboratoř molekulární cytogenetiky a cytometrie, ÚEB, Olomouc: • Raphanus sativus ‘Saxa‘ 2C = 1.11 pg • Lycopersicon esculentum ‘Stupické polní ranné‘ 2C = 1.96 pg • Glycine max ‘Polanka‘ 2C = 2.50 pg • Zea mays ‘CE-777‘ 2C = 5.43 pg • Pisum sativum ‘Ctirad‘ 2C = 9.09 pg • Secale cereale ‘Daňkovské‘ 2C = 16.19 pg • Vicia faba ‘Inovec‘ 2C = 26.90 pg • Allium cepa ‘Alice‘ 2C = 34.89 pg • Bellis perennis 2C = 3.38 pg (Schönswetter 2007) 2C = 3.60 pg (oproti Pisum sativum) 2C = 3.77 pg (oproti Glycine max)

13. Standardy & standardizace • hodnoty jsou kalibrované oproti člověku, 2C = 7.00 pg(Tiersch et al. 1989, Cytometry A, 10: 706-710) • problémy • hodnota pravděpodobně nadsazená o 5-10% • není shoda; rozmezí 6.0-7.0 pg, nejčastěji 6.2-6.4 pg • zatím není kompletní sekvence pro srovnání (repetitivní úseky) • viz Doležel & Greilhuber 2010, Cytometry A, 77: 635-642 • alternativa • Oryza sativa ‘Nipponbare‘; téměř osekvenovaný genom (~95%) → snad celkem přesné (Veselý et al. 2012, Ann. Bot. 109: 65-75; Šmarda et al. 2012, New Phytol. 193: 513-521) • hodnoty o cca 10% nižší než obvyklé • nevýhody: malý genom (2C = 0.777 Gbp = 0.79 pg), zatím není v FCM obecně akceptováno, sekvence není kompletní

14. Standardy & standardizace • problémy 2 • tabelované hodnoty rostlinných standardů na sebe přesně nesedí • závěr: uvádět kromě jména standardu i jeho velikost genomu použitou při výpočtu • možnost přepočítat výsledky v budoucnu • nutná informace pro interpretaci rozdílů mezi studiemi apod. • pokud možno používat některý ze „zavedených“ standardů

15. Příprava vzorku (trocha alchymie) Výběr tkání • lze analyzovat prakticky cokoliv • pokud možno bez sekundárních metabolitů • nezbarvené struktury (bez antokyanů) • ne hodně mladé • listy • nejčastější, nejsnáze dostupné • někdy problém se sek. metabolity (včetně slizů apod.) • méně v řapících než v čepeli • u mladých listů někdy výrazný podíl G2-fáze • v pletivu cévních svazků někdy endopolyploidie

16. Příprava vzorku (trocha alchymie) Výběr tkání • pokožka stonku • podobný charakter jako listy • relativně málo buněk → víc materiálu • dobrá alternativa u hnijících, vadnoucích,… vzorků • koruny • obvykle méně sek. metabolitů (ale ne vždy) • obvykle méně problémů s endopolyploidií • málo buněk, hůř se shání, míň vydrží,… • kořeny • relativně vydrží • spíš více sek. metabolitů, horší kvalita analýz, někdy výrazný podíl 4C buněk

17. Příprava vzorku (trocha alchymie) Výběr tkání • semena • vydrží dlouho, lze přivést i z odlehlých lokalit • prakticky bez inhibitorů (sek. metabolitů) • většinou o něco horší kvalita analýz (CV) • jiné zacházení než s vegetativními tkáněmi • jiné doby barvení, někdy nutno použít speciální pufr,… • někde omezení malými rozměry semene • většinou mírně (~ procenta) jiné výsledky než z listů, nelze přímo srovnávat • jiná struktura chromatinu • jiné chemické prostředí (méně nukleáz, méně inhibitorů,…?) • jiný jedinec než mateřská kytka, třeba analyzovat víc semen • hybridi, neredukované gamety,…

18. Příprava vzorku (trocha alchymie) Složení izolačních pufrů • látky stabilizující pH (Tris, MOPS,HEPES) – většinou pH > 7 • stabilizace chromatinu (Mg2+ nebo spermine) • chelatační látky (EDTA, citrát sodný) – vazba kationtů – kofaktorů nukleáz (Mn2+, Mg2+) (ale viz předchozí bod) • soli určující iontová síla roztoku (NaCl, KCl) • detergenty (Tween20, Triton-X-100) – lepší uvolnění jader, snižují agregaci částic, oddělení zbytků buněk apod. • antioxidanty (2-mercaptoethanol, DTE, PVP,…) – udržují strukturu proteinů v chromatinu, působí proti fenolickým látkám

19. Příprava vzorku (trocha alchymie) Otto I + II pufry – zvláštní případ • tzv. dvoustupňová metodika • Otto I - fixace jader kys. citronovou (+ detergent) • stabilizace jader • homogenizuje strukturu chromatinu (snižuje rozdíly dané různou jeho kondenzací) • Otto II – stabilizace pH, citrát-fosfátový pufr (McIlvaine’s buffer) • při poměru 1:4 výsledné pH ~ 7.3 • přidáváme antioxidanty (2-mercaptoethanol)

20. Příprava vzorku (trocha alchymie) Postup izolace jader • mechanická homogenizace ve vhodném pufru • vzorek i standard spolu, množství třeba vyzkoušet • sekání žiletkou, drcení mezi listy šmirgl papíru,… • vhodný pufr třeba vyzkoušet, nejčastěji Otto I nebo LB01 • přefiltrování (tkanina 42 μm) • stabilizace jader • dobu třeba experimentálně vyzkoušet (<1 min – desítky minut) • přidání barviva, barvení • dobu třeba experimentálně vyzkoušet (větš. do několik min)

21. Doležel et al. 2007 Příprava vzorku (trocha alchymie) Fluorescenční barviva • DAPI, AT-selektivní • citlivější, většinou nízká CV • stanovení ploidie, prokázání drobných rozdílů ve velikosti • propidium jodid (PI), interkalační,bez specifity k bázím • méně přesné (vyšší CV) • vazba i na dsRNA – přidání RNasy • stanovení velikosti genomu v absolutních jednotkách • saturované koncentrace • 4 μg/ml pro DAPI; 50 μg/ml pro PI a RNasu

22. ellagic acid (kys. ellagová) tannic acid Sekundární metabolity • jeden z hlavních zdrojů problémů • zejména polyfenoly (polyphenolics) • odvozené od fenolu, s mnoha volnými OH skupinami, tvorba vodíkových můstků) • více skupin, např. taniny (třísloviny),flavonoidy (kondenzované taniny; patří sem i antokyany),… • pomocí vodíkových můstků se vážína proteiny i DNA • v oxidované formě (chinony) se váží kovalentně na karboxylové skupiny • mimo jiné proto se dávají do pufrů antioxidanty

23. Sekundární metabolity • snižování fluorescence (inhibice) • zabraňují vazbě barviv na DNA • možná „zhášení“(quenching) fluorescence ? • zvyšování fluorescence(coatings of debris) • vazba polyfenolů naproteiny jádra • vazba („nabalování“) různých autofluores-cenčních molekul • shluky malých molekul → pozadí Loureiro et al. 2006, Ann. Bot 98: 515-527

24. Sekundární metabolity, degradace • test na přítomnost inhibitorů • porovnánífluorescencestandardu samotného a ve směsi se vzorkem • in silico oddělení „čistých“ jader (gating) • fluorescence × SSC

25. Stanovení velikosti genomu • počítán poměr vzorek / standard • lineární škála, linearita měření • obvyklé nároky na kvalitu: • interkalační barviva (PI, EtBr) • interní standard • jeden jedinec / vzorek • nejméně 5000 částic u dobrých vzorků (ideálně píktvořen > 1000 částicemi) • přesnost: CV ≤ 3.0% • reproducibilita: 3 opakovanáměření jedince v různé dny,rozpětí ≤ 2% • nejméně 3 jedinci / populace Batrachium 415,89 Bellis (2C = 3,60 pg) 206,18 poměr 2,017 Batrachium 2C= 2.017 * 3.60 Batrachium 2C= 7.26 pg

26. Stanovení velikosti genomu Srovnatelnost výsledků (při dodržení standardní metodiky a kvalitních vzorcích) • v rámci jedné laboratoře OK • mezi laboratořemi často rozdíly: • různé interní standardy • různé izolační pufry • rozdíly mezi konkrétními přístroji (a to i stejného typu od stejného výrobce !) • rozdíly v řádu jednotlivých % jsou celkem dobrá shoda • někdy rozdíly i okolo 10%(Doležel et al. 1998, Ann. Bot. 82, suppl. A: 17-26)

27. Stanovení ploidie • menší nároky než stanovení velikosti genomu • často stačí 3000 jader • nejsou třeba opakovaná měření • lze použít AT-selektivní (GC-selektivní) barviva • v rámci rodu / skupiny druhů poměr bází ± stabilní • lze kombinovat více jedinců do 1 vzorku • třeba vyzkoušet na umělé „směsi“ – v kolika jedincích se spolehlivě rozliší 1 jedinec jiné ploidie • u dobrého materiálu i 10 ks / vzorek → až 1000 ks / den !

28. Stanovení ploidie • ploidie odhadována nepřímoz velikosti genomu • předpoklad, že velikostgenomu sleduje násobky počtu chromozómů • neplatí přesně (např. genome downsizing) • druhy stejné ploidie se mohou lišit • agmatoploidie apod. • je třeba kalibrace přímým počítáním chromozómů • rozlišovat! • ploidní úroveň – kalibrovaná chromozómovými počty • DNA ploidní úroveň – nekalibrovaná chromozómovými počty

29. Aneuploidie, homoploidní variabilita • zvýšené nároky na přesnost – nízké CV → použití DAPI • při stejné výšce píků (!) spolehlivě detekovatelný rozdíl ~dvojnásobku CV • u většiny materiálu ≥ 4% • odchylka o 1 chromozómu počtů do max. cca 25 • rozlišovat mezi rozdílem dvou vzorků a rozdílem průměrů více vzorků • rozdíl 2% mezi vzorky je pod chybou měření • rozdíl o 2% mezi průměry může být statisticky průkaznýa může reálně něco znamenat • kalibrace přímým počítáním chromozómů

30. Fixované tkáně Chemická fixace • obvykle poměrně složité, vyžadující laboratoř, často -20°C,… • použitelné výsledky i po několika týdnech / měsících Kolář et al. 2012, Chromosome Res. 20: 303-315 [Otto I + glycerol] Vysušené tkáně– herbáře, silikagel • většinou použitelné jen na stanovení ploidie (analýzy s DAPI) • horší kvalita analýz (ale ne vždy), snížení fluorescence až o 10% • druhově a tkáňově specifické, nepredikovatelné • vyšší ploidie / větší genomy degradují v průměru rychleji • pokud možno analyzovat po jednom jedinci • životnost vzorků výrazně prodlužuje zamražení (-20°C / -80°C) • asi 75% druhů nejméně po několika týdnech i za pokojové tepl. Suda & Trávníček 2006, Cytometry A, 69: 273-280 [herbáře] Suda & Trávníček 2006, Current Protocols in Cytometry, Willey [silikagel]

31. Endopolyploidie, buněčný cyklus • výskyt více velikostí genomu (píků) v rámci jedince • problémy při interpretaci (poloha 1. píku) • větší počet buněk v G2 fázi • mladé rychle rostoucí orgány • někdy semena • endopolyploidie • buňky se zreplikovanými chromozómy bez dělení buňly • specifická pro někt. taxony (Brassicaceae,Caryophyllales, polopar. Orobanchaceae) • v některých tkáních výraznější (dělohy, řapíky, stonky, cévní svazky,…) • artefakt – slepená jádra • většinou nevýznamné; odlišný peak width

32. Reprodukční systém FCSS – flow cytometric seed screen • dvojité oplození krytosemenných rostlin • normálně: embryo (1C♀ + 1C♂) a endosperm (2C ♀ + 1C♂) • sexuální heteroploidní hybridizace (jiný druh nebo neredukované gamety): • 2x♀ × 4x♂ → embryo 3x + endosperm 4x • 4x♀ × 2x♂ → embryo 3x + endosperm 5x • různé odchylky: • autonomní endosperm • apomixie různého typu

33. Reprodukční systém Matzk et al. 2000

34. Reprodukční systém Matzk et al. 2000, Plant Journal 21: 97-108 • příprava vzorku (drcení / sekání semen), seed buffer, základní interpretace výsledků • ve zralém semeni nejsou zachována žádná buněčná jádra pocházející od matky (+ totéž plucha / pluška u trav) • endosperm zachován jen jako tzv. aleuronová vrstva • obvykle dvě ploidie – embryo (a dělohy) + endosperm • analyzovány společně – embryo jako endogenní standard • externí standardizace pro určení ploidie embrya • vzácně endopolyploidie v endospermu (Arabidopsis, Zea,…) • z ploidií embrya i endospermu dedukován způsob vzniku semene

35. Reprodukční systém Příklad – rod Sorbus (M. Lepší, P. Vít, et al.) • diploidi: sexualita • polyploidi: pseudogamie,vzácně sexualita sexualita red. gamety apomixie: pseudogamie pyl 3x (S.eximia) endosperm 2*3x + 2*3x 2× oplození centr. jádra pyl 2x (S.danubialis) endosperm 2*3x + 2x pyl 3x (S.eximia) endosperm 2*3x + 3x

36. Pyl • technické potíže • většinou nelze celá pylová zrna – autofluorescence, velikost, nepropustnost pro barviva,… • izolace jader obtížná – mnoho metodik, žádná univerzální • interpretace • různý vývoj pylových zrn u různých skupin rostlin • různá ploidie jader (nemusí být všechna 1C) • nutno znát u konkrétního materiálu • neredukované gamety • možná kontaminace vegetativní tkání prašníku • odlišení slepených jader od skutečných neredukovaných gamet - kritické hlavně při vzácnosti nered. pylu (peak width) • jádra v G2 fázi (neodlišitelné)

37. Doležel et al. 2007 GC/AT poměr • zastoupení bází v genomu • u kytek 47-70% AT • porovnání fluorescence specifické (např. DAPI) ainterkalační (např. PI) barvy • GC/AT poměr standardu • kompletně sekvenované organismy (→ skoro nejsou) • pro Pisum sativum odhad 61.5% AT, 38.5% GC • přesnost = hrubý odhad • 1% z 1Gbp genomu je 10 Mbp! Barow & Meister 2000, Cytometry 47: 1-7 Šmarda et al. 2008, Ann. Bot. 101: 421-433

38. F = fluorescence n = binding length p(AT) = podíl AT GC/AT poměr • poměry fluorescencí = dye factor • binding length – pro DAPI = 4 • z dye factor a binding lengthpočítáno zastoupení bází • nelze spočítat přesně, různézjednodušené rovnice neboiterativní postupy http://www.sci.muni.cz/botany/systemgr/ download/Festuca/ATGCFlow.xls • několik zdrojů chyb, ale FCMnení horší než chemické metody • nenáhodné rozložení bází, např. repetitivní sekvence • neznámá binding length • rozdíly ve vazbě barev mezi sekvencemi (AATT × ATAT)