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Chapter 3 蛋白质的研究方法 ——Working with proteins

Chapter 3 蛋白质的研究方法 ——Working with proteins. 2010.09.13. How many proteins are contained in an organism?. Bombyx mori genome: 4.5X10 8 bp putative protein: ~14,600 Homo sapiens genome: 3X10 9 bp putative protein: 20,000 ~ 25,000. 研究蛋白质的功能最关键的一步 : 分离纯化蛋白质.

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Chapter 3 蛋白质的研究方法 ——Working with proteins

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Presentation Transcript

  1. Chapter 3 蛋白质的研究方法 ——Working with proteins 2010.09.13

  2. How many proteins are contained in an organism? Bombyx mori genome: 4.5X108 bp putative protein: ~14,600 Homo sapiens genome: 3X109 bp putative protein: 20,000 ~ 25,000

  3. 研究蛋白质的功能最关键的一步: 分离纯化蛋白质 首先,我们要了解蛋白质的特征: • 大小 • 酸碱性 , pI • 溶解性 • 对某些配体的亲和度 • ……

  4. 蛋白质的酸碱性 • 因为受到邻近电荷的影响，蛋白质分子中各氨基酸残基可离解的基团与处于游离状态的氨基酸分子上可离解的基团，pKa不完全相同 • 蛋白质分子所带电荷的正负和数量由蛋白质分子中可离解集团的种类、数目以及溶液pH值决定 • 在没有盐离子存在的情况下（即纯水中），蛋白质分子解离出的质子数目和结合的质子数目相等时（即蛋白质处于净电荷为零时），溶液的pH值为等离子点 在纯水中，蛋白质的等电点即为蛋白质的等离子点，是蛋白质的特征常数

  5. 蛋白质的溶解性 • 蛋白质分子的质点半径介于1~100nm范围内，蛋白质溶液为胶体溶液 • 蛋白质分子表面的亲水基团和水分子发生水化作用，形成水化层 • 蛋白质分子在适当的pH值情况下，带同种符号的净电荷，因此不会相互聚集而沉淀 • 改变蛋白质分子的大小、水化作用和电荷，就能改变蛋白质溶液的稳定性

  6. 蛋白质沉淀的方法 • 盐析法 —— 破坏水化层 • 有机溶剂沉淀法 —— 破坏水化层以及降低介电常数增加异性电荷间的相互作用 • 重金属盐沉淀法 —— 破坏蛋白质分子的净电荷 • 生物碱或某些酸沉淀 ——破坏蛋白质分子的净电荷 • 加热变性沉淀法 —— 破坏氢键，改变蛋白质的天然构象，疏水基团暴露，水化层破坏

  7. 蛋白质分离纯化的步骤 • 前处理 —— 把蛋白质从原来的组织或者细胞中以溶解的状态释放出来，并保持原来的天然构象和生物活性 • 初分离 —— 将所需要蛋白质与其他杂蛋白质分离开来（沉淀法） • 细分离 —— 纯化和结晶

  8. 蛋白质分离纯化的方法 （一）透析和超过滤 • 透析(dialysis) 利用蛋白质分子不同通过半透膜的性质来分离蛋白质和小分子

  9. 超过滤(ultrafiltration) 利用压力和离心力，强行使水和其他小分子通过半透膜

  10. （二）凝胶过滤(gel filtration) 大小排阻(size-exclusion)或凝胶渗透(gel permeation)层析 • 分级分离范围(fractionation range) • 排阻极限(exclusion limit) • 凝胶的种类：交联葡聚糖、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖

  11. 柱床体积（Vt）：凝胶柱床的总体积 • 洗脱体积（Ve）：从加样品开始到某一待分离物质组分流出的体积 • 孔隙体积或外水体积（Vo）：柱床中凝胶珠外孔隙的水相体积 • 内水体积（Vi）：凝胶珠内部的水相体积 • 凝胶基质体积（Vm） Vt = Vo + Vi + Vm 流动相 固定相

  12. Ve - Vo Kd = Vi 对于完全排阻在凝胶孔隙之外的分子： Ve = Vo 对于完全自由进出凝胶孔隙的分子： Ve = Vo + Vi Kd = 0 Kd = 1

  13. （三）盐溶和盐析(salting in/out) • 盐溶 —— 中性盐在低浓度的时候，使蛋白质分子带相同的电荷而彼此排斥，且蛋白质分子与水之间的相互作用增强，因此提高溶解度 • 盐析 —— 大量中性盐使水的比活降低，蛋白质分子的水化层被破坏，疏水基团暴露，蛋白质分子间相互作用产生沉淀

  14. （四）有机溶剂分级分离法 在一定温度、pH值和离子强度条件下，不同浓度的有机溶剂引起不同蛋白质的沉淀

  15. （五）凝胶电泳和等点聚焦 电泳(electrophoresis): 在外电场的作用下，带电颗粒向着与其电负性相反的电极移动 v/E = q/f

  16. Coomassic blue staining Silver staining • 考马斯亮蓝染色：染料物理吸附到Arg、芳香族氨基酸以及组氨酸上 • 银染：Ag+ 吸附到氨基酸上，然后甲醛作为还原剂还原Ag+ ，从而使蛋白质显出黑色

  17. 等点聚焦(IEF，isoelectric focusing)

  18. (Ion-exchange chromatography) （六）离子交换层析

  19. （七）亲和层析(affinity chromatography)

  20. （八）高效液相色谱(HPLC)

  21. 蛋白质相对分子质量的测定 （一）凝胶过滤法 • 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子的质量，而是它的斯托克半径 • 待测蛋白质分子的形状和标准蛋白质相似（接近球体） lgMr = a - bVe

  22. （二）SDS-PAGE 每两分子氨基酸残基结合一个SDS分子

  23. 结合SDS导致： • SDS使多肽链覆盖上相同密度的负电荷，该电荷量远远超过蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同蛋白质原有的电荷差别 • 改变了蛋白质的天然构象，使大多数蛋白质分子采取类似的形状。 logMr = a - bmr

  24. Gel electrophoresis

  25. 影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。

  26. （三）沉降速度法 1. 分子量大小 2. 形状 3. 密度 4. 介质的黏度 用沉降系数（s）来区分不同的蛋白质 s越小，离心场里就越难沉淀

  27. 蛋白质含量和纯度的测定 （一）蛋白质含量的测定 • Bradford assay When Coomassie Brilliant Blue G-250 binds to proteins in acid solution, it has an absorbance shift from 465 nm to 595. Lambert-Beer’s law: A=Log Io/I = ecl e, molar extinction coefficient（摩尔吸光系数，L/mol·cm） c, concentration (mol/L); l, optical length (cm)

  28. （一）蛋白质纯度的测定 • 电泳 • 离心 • HPLC

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