CA García Sepúlveda MD PhD

1. Tema 4 Replicación del DNA CA García Sepúlveda MD PhD Laboratorio de Genómica Viral y HumanaFacultad de Medicina, Universidad Autónoma de San Luis Potosí

2. Sin importar el número de cromosomas que posea una célula (1 en una bacteria o 1400 en Ophioglossum) el genoma completo debe ser duplicado (replicado) un sola vez y de una manera fiel con cada división celular. La iniciación de la replicación del DNA obliga a la célula (procariota o eucariota) a dividirse. La replicación se controla UNICAMENTE durante la iniciación, una vez iniciada no se puede ni regular ni apagar, continua hasta copiar todo el genoma. Tema 3. Replicación del DNAIntroducción

3. Tema 3. Replicación del DNATeorías propuestas Tres hipótesis de replicación del DNA propuestas.

4. Una vez finalizada la replicación es necesario separar (Segregar) a las dos copias del material genético de tal manera en que se hereden de manera equitativa. La división celular no puede ocurrir mientras no se haya terminado la replicación. Se cree que la terminación de la replicación es la señal que mueve a la célula a dividirse. Tema 3. Replicación del DNAObjetivo

5. Definición de trabajo: Cualquier secuencia de DNA flanqueada por un sitio de origen y un sitio de terminación de la replicación. El origen y el término constituyen secuencias de DNA con efectos cis (sobre la misma cadena de DNA) que permiten la iniciación y terminación de la replicación. Tema 3. Replicación del DNAReplicón

6. En los procariotas la replicación involucra solamente a un cromosoma y un solo sitio de iniciación, el proceso de división celular se caracteriza por la formación de un septum(pared) a la mitad de la célula). En los eucariotas, la replicación se realiza durante la fase S del ciclo celular (sintesis) a través de multiples sitios de iniciación, la división celular requiere de la reorganización mitótica de la célula (MTOCs, etc). Replicón (Definición): Tema 3. Replicación del DNAReplicación procariota La unidad de DNA en la cual se lleva a cabo la replicación. Una porción de DNA que es replicada por un solo origen y que posee los elementos necesarios para iniciar la replicación (origen y termino).

7. Una de las diferencias que nos distinguen de los procariotas es que nosotros POSEEMOS MULTIPLES REPLICONES. La unidad de segregación (cromosoma) posee multiples unidades replicativas (replicones). Multiples replicones por cada cromosoma, cada uno de los cuales es “disparado” una sola vez durante el ciclo celular aunque no de manera simultánea. Tema 3. Replicación del DNAReplicones eucariotas Algún tipo de señal debe distinguir a los replicones “disparados” de los “no-disparados”. Algún tipo de señal debe indicarle a la célula que todos los replicones han sido disparados y que puede continuar con la división celular.

8. Es el sitio en que ocurre la replicación. La imagen clásica de los flancos del replicón es la de la horquilla de replicación. Pérdida de las jerarquias superiores de compactación. Desnaturalización de duplex de DNA para dar acceso al complejo replicativo Tema 3. Replicación del DNAHorquilla de replicación

9. Tema 3. Replicación del DNAHorquilla de replicación El ojo replicativo puede moverse en uno o ambos sentidos (UNIDIRECCIONAL y BIDIRECCIONAL). Unidireccional = una sola horquilla de replicación hace uso del sitio de origen hasta que llega a un término (o se cae de la cadena de DNA si está muy cerca del extremo cromosómico). Bidireccional = Dos horquillas de replicación hacen uso del mismo origen extendiendo el DNA en sentidos opuestos, EL MÁS COMÚN EN LOS EUCARIOTAS. En cualquier caso, las comisuras de los ojos replicativos se extienden hasta abracar a todo el replicón (o todo el cromosoma).

10. Tema 3. Replicación del DNAReplicón procariota El genoma de E. coli es replicado bidireccionalmente a partir de un solo origen identificado como el locus oriCcuya secuencia esencial es de 245 bp. El “trasplante” del locus oriCa cualquier fragmento de DNA circularizado genera un plasmido artificalcapaz de autoreplicarseen E. coli. En términos generales, un origen es capaz de permitir la replicación de cualquier secuencia de DNAunida a él. Estas secuencias se han caracterizado para algunas bacterias, levaduras, cloroplastos y mitocondrias aunque no para los eucariotas superiores. Suelen ser ricas en AT(presumiblemente relacionado con la facilidad de desnaturalización que brindan dichas secuencias). No dije repeticiones AT asi que no tiene que ver nada con zDNA!

11. Tema 3. Replicación del DNAReplicón procariota Las secuencias responsables de detener el proceso replicativo se denominan Sitios de terminación (ter). En procariotas los sitios ter abarcan ± 23 bp y han sido caracterizados. Los sitios terson elementos cisque funcionan en una sola dirección, son reconocidos por la proteina tuslo cual impide la progresión de la replicación. Las dos horquillas de replicación de E. coli suelen toparse una con otra a la mitad del camino y casi en el sitio contrario al del sitio de origen (como cabría esperar).

12. Tema 3. Replicación del DNAReplicón eucariota En los eucariotas la replicación del DNA se restringe a la fase S del ciclo celular. Velocidad de las horquillas de replicación procariotas: 800 b/seg (50,000 b/min). Velocidad de las eucariotas es de 30 b/seg (2000 b/min). 3x109 bases/2000 = 1'500,000 minutos = 25,000 horas = 1,041 días = 2.8años HoSa utiliza de 30,000 - 90,000 replicones lo que debería permitir lograr la replicación total en menos de 45 minutos! En realidad, solamente el 15% de los replicones están encendidos a la vez...con lo cual la fase S ocupa un poco más de 6 horas (paa disminuir entropia). Existen entre 100 y 300 foci replicativos en los eucariotas, cada foco posee >300 horquillas de replicación.

13. Tema 3. Replicación del DNAReplicón eucariota Los replicones procartioas son gradnes (entre 4 y 10 millones de bp). Los eucariotas son más pequeños y variables (promedio de 40,000, desde 4000 hasta 100,000 bp). A diferencia de los replicones circulares procariotas los replicones eucariotas no tienen secuencias ter, la DNA polimerasa simplemente extiende la cadena hasta toparse con una DNA pol en la drección opuesta, tras lo cual se desprende... ...o se “cae” del cromosoma una vez ha alcanzado su extremo terminal.

14. Tema 3. Replicación del DNAParadigma de la replicación terminal Todas las DNA y RNA polimerasas conocidas escriben unicamente en sentido 5'  3'. La DNA pol no puede sintetizar DNA sin un hidroxilo-3' del cual colgarse, por lo que es necesario un primer o cebador. La RNA pol NO requiere del hidroxilo-3' para polimerizar acidos nucleicos.

15. Tema 3. Replicación del DNAParadigma de la replicación terminal Los primers de RNA son retirados después de servir su función. De alli el paradigma de la replicación de un fragmento linear de DNA (lleva necesariamente al acortamiento gradual del mismo.

16. Tema 3. Replicación del DNAParadigma de la replicación terminal • 1.- Circularizar genoma (como lo hacen las bacterias y fagos T4 o ). • 2.- Formación de asas terminales (variante de la primera), usado en el genoma mitocondrial de Paramecium y nuestros telomeros. • 3.- Empleo de una proteína terminal que brinde un OH-3’ no nuceotídico libre, tal cual lo hacen los Adenovirus y poliovirus. • 4.- Secuencias repetitivas y telomerasas para extender los extremos: telómeros eucariotas.

17. Tema 3. Replicación del DNAEventos replicativos La replicación del DNA constituye un proceso complejo que requiere de la actividad de más de una enzima. Tiene tres etapas: Iniciación, elongación y terminación.

18. Tema 3. Replicación del DNAIniciaciación de la replicación Reconocimiento del sitio de origen de un replicón por parte de un complejo de proteínas (ORC) que permite la unión a otro complejo proteico llamado primosomaen E. coli. Una porción del DNA parental debe desnaturalizarse y estabilizarse en forma monocatenaria para permitir el acceso al complejo proteico encargado de la elongación (Complejo de Progresión Replisomal o RPC).

19. Tema 3. Replicación del DNAElongación de la replicación Polimerización de cadenas hijas. A cargo de otro complejo proteico llamado el replisoma. El replisoma no constituye un complejo proteico aislado (como los ribosomas) sino que resulta de la agregación de varias proteínas a nivel de las horquilla de replicación e incluye no solo a las proteínas sino también al DNA que sirve de referencia. Durante esta fase las hebras de DNA parental son desenrolladas y las cadenas hijas son sintetizadas.

20. Tema 3. Replicación del DNATerminación de la replicación Todos aquellos eventos que suceden desde que se termina de sintetizarla nueva molécula hija hasta la segregacióncromosómica. Unión de fragmentospertenecientes a replicones contiguos. Disolución de complejos proteicosinvolucrados en la iniciación y elongación de la replicación.

21. Tema 3. Replicación del DNADNA polimerasas Enzimasque pueden sintetizar una nueva cadena de DNA a partir de otra de referencia. Solamente pocas DNA polimerasasparticipan en la replicación del DNA: Replicasas La mayor partede las DNA polimerasas se ven involucradas en la reparación de DNA. La síntesis de DNA no depende de una sola enzima sino de un complejo enzimático multimérico. La actividad replicativa es tan solo una de las funcionesasociadas al replisoma.

22. Tema 3. Replicación del DNADNA polimerasa III (replicasa procariota) Gran complejo multimérico con actividad sintética. Subunidades ,  y . Subunidad  brinda actividad sintética de replicasa codificada por locus dnaE. Subunidad  responsable de capacidad correctiva en sentido 3'  5', codificada por locus dnaQ. La subunidad incrementa lacapacidad correctiva de la subunidad .  

23. Tema 3. Replicación del DNADNA polimerasa III (replicasa procariota) Modelo cristalográfico de la subunidad catalítica de la DNA pol del fago T7. Modelo en esferas de Van der Waals y listones. DNA (azul) y primer de RNA (verde claro). Modelo de mano derecha, pulgar (amarillo), dedos (verde) y palma (violeta). Tioredoxina (rojo) es una proteína antioxidante Cys-SH que reduce a otras proteínas y permite generar el modelo. Nucleótido por ser incorporado (crema).

24. Tema 3. Replicación del DNADNA polimerasa III (replicasa procariota) La holoenzima es un complejo de 900 kD con varias subunidades: Coro catalítico Incluye a la subunidad aresponsable de la actividad sintética. La subunidad e responsable de la actividad de exonucleasa 3'  5'. La subunidad q estabiliza la actividad de e y participa en el ensamblaje del coro. Componente de procesividad (Clamp b) Cargador del Componente de procesividad (Clamp loader, Subuniad g). Incluye a la subunidad g, La subunidad d, La subunidad d1, La subunidad c, La subunidad y, Componente dimerizante (Subunidad t, responsable de la dimerización de coros).

25. Tema 3. Replicación del DNADNA polimerasa III DNA polimerasa en la horquilla de replicación Tres componentes esenciales en el replisoma de la figura: 1.- Helicasa (DnaB) 2.- Primasa (DnaG) 3.- Dímero de DNA polimerasa III Helicasa avanza por delante de la horquilla de replicaciónagarrada de una cadena de ssDNA abriendo el dúplex de DNA localizado por delante de ella. Girasa para aliviar super-embobinamiento por delante de helicasa (no mostrada en esta figura). La Helicasa “jala” a dímero de DNA polimerasa III en sentido 5'  3'. En el sitio de origen, la primasa coloca el oligonucleótido cebador sobre referencia líder, conforme avanza la horquilla de replicación la DNA polimerasa de la cadena líder la extiende sin problemas.

26. Tema 3. Replicación del DNADNA polimerasa III La extensión de la cadena líder ocasiona una asa por delante de la DNA polimerasa correspondiente a la cadena retardada. De manera periódica, la DnaB (helicasa) recluta a la DnaG (primasa) para cebar el siguiente fragmento de Okazaki. Una vez cebado el fragmento de Okazaki, se desprende la primasa y la DNA polimerasa correspondiente extiende el fragmento de Okazaki hasta topar con el anteriormente sintetizado...este proceso incrementa incluso más el tamaño de la asa de ssDNA por delante del complejo ipsilateral. Una vez que la DNA polimerasa ha terminado el fragmento de Okazaki, se disocia el Clamp  para volverse a formar en un lugar próximo a la horquilla de replicación (a donde la DnaG primasa ha sido nuevamente reclutada por DnaB (helicasa).

27. Tema 3. Replicación del DNACebado (priming) de la replicación Tipos de cebadores 1.- Sintetizar un primer de RNA (empleado por células eucariotas). 2.- Hibridización de primer de RNA prefabricado como un hexmero aleatorio (empleado por retrovirus). 3.- Exponer hidroxilo 3' con endonucleasa. 4.- Empleo de proteína terminal covalentemente unida al DNA.

28. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua Recordemos que las cadenas que forman el dúplex de DNA son antiparalelas. Durante la replicación ambas cadenas deben ser replicadas al mismo tiempo (Sería energéticamente desfavorable duplicar el esfuerzo al replicarlas independientemente).

29. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua Las DNA polimerasas únicamente sintetizan DNA en sentido 5'  3'. No hay problema con la cadenaLIDER que se elonga en sentido 5'  3' ya que será sintetizada continuamente en sentido del avance de la horquilla replicativa. Problema con la cadena retrasada que se elonga en dirección contraria al del movimiento de la horquilla.

30. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua Esto requiere de que por un tramo corto al menos, una enzima se dirija en sentido contrario al del avance de la horquilla de replicación para sintetizar la otra cadena (cadena retardada). Mientras que la replicación directa de la cadena líder puede continuarse hasta el final (del cromosoma o del replicón), la cadena retardada debe ser sintetizada en pequeños tramos (de entre 1000 y 2000 bp) (fragmentos de Okazaki).

31. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua Los fragmentos de Okazaki se observan tanto en eucariotas como en procariotas. Si uno pulsara brevemente a una célula en fase S con DNA radiomarcado los fragmentos de Okazaki se evidenciarían como segmentos aislados de DNA (como dijimos entre 1 y 2 kbp).

32. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua Si dejamos transcurrir unos minutos, los fragmentos radiomarcados comienzan a incrementar su tamaño (sugiere que hay un mecanismo que los une posteriormente). Replicación semidiscontinua = la cadena líder de DNA es replicada continuamente, mientras que la cadena retardada es sintetizada de forma discontinua. Recordemos que las DNA polimerasas requieren de un cebador que brinde un hidroxilo 3' para poder polimerizar nucleótidos. Esto implica que la cadena líder requiere de un solo cebador para ser replicada (localizado en el origen), pero la cadena retardada requiere de varios cebadores, uno para cada fragmento de Okazaki.

33. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua • Aun desconocemos los detalles completos de este evento, pero sabemos que incluye los siguientes pasos: • Reconocimiento de las soluciones del continuo. • Remoción de los oligonucleótidos de RNA. • Reemplazo de los oligonucleótidos por DNA. • Unión covalente de los fragmentos de Okazaki contiguos. La síntesis de los fragmentos de Okazaki termina al chocar con el extremo 5' del oligo previamente tendido (o por proteínas del complejo de iniciación asociadas al DNA en el caso del primer fragmento sintetizado para la horquilla). En los procariotas los oligos de RNA son retirados con la actividad de exonucleasa 5'  3' de la DNA pol I, enzima que se encarga de la síntesis de DNA correspondiente a partir del hidroxilo 3'.

34. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua El proceso de remoción de oligos en procariotas es muy semejante a nick-translation solo que en vez de reemplazar DNA por DNA, se reemplaza RNA por DNA. En los mamíferos (cuyas DNA pol carecen de la actividad de exonucleasa en sentido 5'  3') este proceso es más complejo: 1.- Una enzima llamada RNAsa H1(específica para híbridos DNA:RNA) con actividad de endonucleasa corta el extremo polimerizado del oligo de RNA. 2.- Una exonucleasa con capacidad 5'  3' llamada FEN1elimina los fragmentos de RNA.

35. Tema 3. Replicación del DNAReplicación semi-discontinua Unión de fragmentos de Okazaki Una vez logrado esto (tanto en los pro- como en los eucariotas), los fragmentos de Okazaki deben ser unidos. Esta responsabilidad recae en una enzima llamada ligasa, la cual une al hidroxilo 3' terminal de un fragmento de Okazaki al Fosfato 5' del fragmento contiguo. PCNA: Proliferating Cell Nuclear Antigen (DNA clamp) RPA: Replication Protein A (SSB)

36. Tema 3. Replicación del DNAHelicasas Para que la horquilla de replicación pueda acceder al DNA de referencia y comenzar su síntesis hace falta desnaturalizar al DNAy mantenerlo en estado monocatenario. Esto se logra gracias a la acción de la Helicasa y de las SSB. Varios procesos biológicos requieren de su actividad (Replicación, transcripción, recombinación, reparación, etc). Existen varios tipos de helicasas (más de 14 en E. coli y alrededor de 24 en los humanos). Las helicasas adoptan distintas estructuras y estados de oligomerización. Las helicasas tipo DnaB forman hexámeros, pero otras helicasas realizan sus funciones como monómeros o dímeros.

37. Tema 3. Replicación del DNAGirasas La translocación de la helicasa lleva a la inducción de super-embobinamiento positivo del dúplex de DNA que tiene por delante. Con el objeto de aliviar la tensión acumulada por este super-embobinamiento, una enzima llamada girasa(topoisomerasa II)relaja al dúplex de DNA induciendo cortes y resanándolos muy por delante de la helicasa.

38. Tema 3. Replicación del DNASSB- Single-Strand Binding Proteins Single-strand Binding Protein (SSB) estabilizan la cadena de DNAdesnaturalizada por la helicasa para evitar su hibridización nuevamente. Son proteínas monoméricasde agregación cooperativa. Agregación cooperativa = la unión de una favorece la unión de otras. Una vez que una SSB se ha unido al DNA, las SSB restantes fácilmente se unen al mismo hasta ocupar su totalidad. Las SSB NO PUEDEN ABRIR EL DNA, esto requiere de la acción de la helicasa.

39. Tema 3. Replicación del DNAModelo global Necesaria para el modelo de replicación semidiscontinua. Mecanismo responsable de asegurar un crecimiento balanceado tanto de la cadena líder como de la retardada. Recordemos que una DNA pol se mueve en dirección del avance de la horquilla de replicación, mientras que la otra realiza pasos repetitivos que requieren de movimientos en sentido contrario al de la horquilla de replicación. Modelo Trombone

40. Tema 3. Replicación del DNAModelo global