1 / 78

Feno- ja genosüstemaatika II

Feno- ja genosüstemaatika II. Genotüübilised tunnused. Genotüübilised tunnused: genoomi suurus. Seda võib määrata kas daltonites või aluspaarides. 1500 bp = 10 6 D. Kõige väiksema genoomiga bakter on Mycoplasma genitalium (0.58 Mb) .

phoebe
Télécharger la présentation

Feno- ja genosüstemaatika II

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Feno- ja genosüstemaatika II

  2. Genotüübilised tunnused

  3. Genotüübilised tunnused: genoomi suurus Seda võib määrata kas daltonites või aluspaarides. 1500 bp = 10 6 D. Kõige väiksema genoomiga bakter on Mycoplasma genitalium (0.58 Mb). Arvatakse, et minimaalne bakterigenoom võiks sisaldada 400-500 geeni. Nende produktidest peaks piisama, et hakkama saada. E. coli’l on 4300 geeni, pärmil S. cerevisiae 6000 geeni, inimesel 30 000 geeni.

  4. Genoomi suurus ja geenide arv

  5. Genotüübilised tunnused: genoomi suurus Ainult genoomi suurus ei ole ilmselt organismi tüsilikkuse määraja, sest näiteks kahepaiksete genoom on 30 x suurem, kui inimese genoom. Siiski kehtib see, et väga väikese genoomiga bakterid (mükoplasmad ja klamüüdiad) on metaboolselt defektsed ja parasiteerivad kõrgematel organismidel. Prokarüootidest on aga näiteks suure genoomiga aktinomütseedid ja müksobakterid, kellel on keeruline morfoloogia, arengutsükkel jne. Myxococcus xanthuse genoomi suurus on 9.45 Mb. Võrdluseks Helicobacter pylori 1.66 Mb; E. coli 4.6 Mb

  6. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Praeguseks on sekveneeritud juba rida bakterite genoome (üle saja genoomi kindlasti 2003 aasta seisuga). Infi saab aadressilt www.tigr.org/tdb/mdb/mdb.html. Esimene bakterigenoom, mis sekveneeriti oli Haemophilus influenzae oma. Väikseima genoomiga senisekveneeritud bakter on Mycoplasma genitalium (0.58 Mb). See annab aimu, kui palju geene võiks ühel bakteril vaja olla.

  7. Preaguseks on väga paljud bakterite genoomid sekveneeritud. Seisuga jaanuar 2004 oli täielikult sekveneeritud ja publitseeritud 169 prokarüootset genoomi ning sekveneerimisel 428 genoomihttp://wit.integratedgenomics.com/GOLD/

  8. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Methanococcus jannaschii (1.66 Mb) oli esimene sekveneeritud arhe. 62% tema valke kodeerivatest geenidest olid unikaalsed, neil ei olnud homolooge andmebaasides. See näitas, et arhed on tõesti bakteritest palju erinevad. Synechocystis sp.(3.57 Mb) on tsüanobakter. 5% tema orfidest olid seotud fotosünteesi funktsiooniga ja 99 orfi andis sarnasuse tranposaasi geeniga, mis näitab, et genoom võib transpositsiooni abil hõlpsasti ümber korralduda.

  9. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Helicobacter pylori (1.67 Mb) genoomi analüüs näitas, et palju on tal geene, mis olid seotud liikuvusega, adhesiooniga ja raua transpordiga. Regulaatorgeene ja sigma-faktorite geen oli suhteliselt vähe. See on ilmselt seotud bakteri stabiilse elukeskkonnaga (inimese magu). Escherichia coli K-12 (4.64 Mb) genoom sisaldas rohkesti IS elemente ja jäänukeid faagi järjestustest, mis annab tunnistust horisontaalsest geenitriivist. H. pylori maohaavandis

  10. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Methanobacterium thermoautotrophicumi (1.75 Mb) genoomi analüüs näitas, et geenid, mis olid seotud DNA metabolismiga, transkriptsiooni ja translatsiooniga, olid eukarüootide omadele sarnased. Genoomi ülesehitus aga oli teistele prokarüootidele sarnane (näiteks esinevad operonid ja on rõngaskromosoom). Bacillus subtilis (4.21 Mb) oli esimene sekveneeritud grampositiivne bakter. Analüüs näitas, et genoomis oli toimunud palju duplikatsioone ja et väga suur osa geenidest oli seotud erinevate süsinikuallikate kasutamisega. Leiti ka vähemalt 19 profaagi, mis näitab, et faagide abil toimuv horisontaalne geeniülekanne võis olla oluline batsillide genoomi evolutsioonis.

  11. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Borrelia burgdorferi B31 (1.44 Mb) genoom on unikaalne, sest ta koosneb lineaarsest kromosoomist (0.91 Mb) ja vähemalt 17-st lineaarsest ja rõngasplasmiidist (kokku 0.53 Mb). Arvatakse, et plasmiidsed geenid osalevad antigeenses muutlikkuses ja immuunvastuse vältimises. B. burgdorferi (puukborrelioosi tekitaja spiroheet) ja erüteem nahal

  12. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Aquifex aeolicus (1.55 Mb) on hüpertermofiilne kemolitoautotroof (oksüdeerib vesinikku). Väike genoom piirab metaboolset paindlikkust. Kuigi ta on hüpertermofiil, leiti genoomist vähe geene, mis võiksid olla sellega seotud. Aquifex on väga vana haru bakterite evolutsioonipuul

  13. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Chlamydia trachomatis (1.04 Mb) on obligaatne rakusisene parasiit. Puuduvad paljud biosünteesi geenid (anaboolne defektsus). Samal ajal on olemas geenid, mis on vajalikud peremeesraku metaboliitide kasutamiseks. Paljud klamüüdiate geenid on sarnased eukarüootide vastavatele geenidele.

  14. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Thermotoga maritima MSB8 (1.86 Mb) on termofiilne evolutsiooniliselt vana eubakter, kellel on leitud väga palju geene (24%), mis on sarnased arhede omadele. Arvatakse, et terved klastrid geene on Thermotoga omandanud arhedelt horisontaalse geenitriiviga. Thermotoga rakul on peal valguline tooga

  15. Genoomide sekveneerimine ja järjestuste analüüs Deinococcus radiodurans R1 (3.28 Mb) on kiirgusresistentne bakter, millel on kaks kromosoomi (2.65 and 0.41 Mb) ja suur ning väike plasmiid (0.178 Mb ja 0.045 Mb). Leiti palju geene, mille funktsiooniks on võitlus oksüdatiivse stressiga, kuivusega, nälgimisega ja DNA kahjustuste likvideerimisega. Deinokokkidel on pigmenteerunud rakud. Ka pigmendil on kiirgusevastane toime

  16. GC% DNAs GC% = (G+C)/(A+T+G+C)x100 1960-ndatel aastatel hakati ühe tunnusena süstematiseerimisel kasutama DNA GC%, mis bakterimaailmas varieerub 20-80%-ni. On stabiilne tunnus. Ei sõltu raku vanusest, kasvatamistingimustest jne. Fenotüüpilised tunnused sõltuvad. Loomadel ja kõrgematel taimedel see tunnus ei varieeru eriti ja on 30-50%. GC% määrati esmalt DNA happelisel hüdrolüüsil saadud produktide paberkromatografeerimisega ja paberilt elueeritud produktide kvantiteerimisega. Võiks määrata ka hüdrolüüsiproduktide määramisega HPLC abil.

  17. GC% DNAs Lihtsam on kasutada aga DNA sulamistäpi määramist, sest see on lihtsam. A ja T vahel on 2 H-sidet, G ja C vahel 3 sidet. Seega on GC-rikkad DNAd termostabiilsemad ja kõrgema sulamistäpiga. DNA preparaati soojendatakse ja mõõdetakse pidevalt neeldumise suurenemist 260 nm juures. Denatureerunud (lahtikeerdunud) DNA neelab rohkem, kui natiivne. Kui kogu DNA on lahtikeerdunud, siis neeldumine enam ei suurene. Seda temperatuuri, mille juures pool DNA-st on denatureerunud, nim. DNA sulamistäpiks (Tm). Et sulamistäpp sõltub puhvri ioonsest jõust, siis peab sulamistäpi määramisel kasutama standardseid puhvreid.

  18. GC% DNAs DNA kuumutamisel katkevad vesiniksidemed DNA kaksikahelas. Mida enam on DNAs GC paare (nende vahel moodustub kaksikahelas 3 vesiniksidet), seda kõrgem on tema sulamistäpp

  19. 1.0 Single stranded DNA Relatively low GC content Relatively high GC content OD260 Tm = 75 oC Tm = 85 oC Double stranded DNA 0 65 70 75 80 85 90 95 Temperature (oC) Determination of GC Content Tm is the temperature at which half the DNA is melted

  20. GC% DNAs DNA kaksikahelat on võimalik soojendades denatureerida üheahelaliseks. Neeldumise järgi ultraviolettkiirguses on võimalik hinnata denatureerunud (üheahelalise) DNA hulka. Temperatuuri, mille juures pool DNAst on denetureerunud, nimetatakse DNA sulamistäpiks. GC% DNAs saab määrata ka DNA sulamistäpi kaudu

  21. GC% DNAs NB! Sarnase järjestusega DNAdel on ka GC% sarnane. Samal ajal võib GC% olla sarnane ka väga erineva järjestusega DNAdel. Seetõttu kasutatakse GC% süstemaatikas selleks, et viia mõnda tüve või liiki mõnest süstemaatilisest üksusest välja. GC% DNAs soovitatakse kasutada liikide ja perekondade määratlemisel ühe genoomse karakteristikuna. Näiteks, kui kaks liiki on muidu fenotüübilt väga sarnased, aga GC% DNAs on palju erinev, siis ei kuulu need liigid ühte perekonda ja nende süstemaatika tuleks üle vaadata.

  22. GC% DNAs Empiiriliselt on näidatud, et ühe perekonna liikidel ei erine GC% DNAs rohkem kui 10% võrra ja ühe liigi tüvedel rohkem kui 5% võrra. Kui kahe mikroorganismi DNA GC% erineb rohkem kui 20-30%, siis neil DNAdel ei ole sarnaseid järjestusi. NB! Kui mingi organismi genoomist leitakse geene, mille GC% erineb tunduvalt selle organismi tüüpilisest GC%-st, siis on ilmselt tegu horisontaalse geenitriiviga omandatud geenidega.

  23. GC% DNAs GC% on osutunud väärtuslikuks tunnuseks graampositiivsete bakterite jagamisel kaheks alagrupiks:körge ja madala GC-sisaldusega graampositiivsed bakterid. Esimesse kuuluvad aktinomütseedid ja teise näiteks batsillid, stafülokokid, klostriidid ning piimhapebakterid.

  24. Näiteks perekonna Staphylococcus liikidel on GC% DNAs 30-38%, perekonnas Micrococcus 64-75%. Mikrokokid ja stafülokokid on fenotüübilt hästi sarnased, aga juba GC% näitab, et nad ei ole sugulased. GC% varieeruvus perekonna piires on nende kahe perekonna puhul OK, so. 10% piires.

  25. DNA denatureerimine ja renatureerimine DNA kuumutamisel katkevad vesiniksidemed DNA kaksikahelas. Jahutamisel need sidemed taastuvad ja DNA kaksikahel moodustub taas

  26. Hübriidsed kaksikahelad Ka erinevatest organismidest pärinevat denatureeritud DNAd anna kokku segades renatureerida. Sel juhul saavad moodustuda ka hübriidsed kaksikheeliksid, kui kahe organismi DNA järjestused on piisavalt sarnased

  27. DNAde homoloogsuse võrdlemine bakteritel võimaldab määratleda nende suguslust DNAde homoloogsuse määramine bakteritel võimaldab määratleda nende suguslust Mida enam tekib hübriidseid kaksikahelaid, seda sarnasemad on järjestuselt need võrreldavad DNAd.

  28. DNAde homoloogsuse määramine bakteritel võimaldab määratleda nende sugulust Loomulikult saab DNAde sarnasust määrata ka DNA de sekveneerimisega ja saadud järjestuste võrdlemisega vastavate arvutiprogrammidega,

  29. DNAde homoloogsuse määramine Eralda ühe bakteri DNA, denatureeri ja seo filtrile (nitrotselluloos- või nailonfilter). Seejärel hübridiseeri filtri pinnal teise bakteri danatureeritud radioaktiivse DNAga. Hübridiseerumata DNA pese filtrilt maha (töötle nukleaasiga) ja määra filtri radioaktiivsus. Mida suurem see on, seda lähedasemad on uuritavad bakterid.

  30. DNAde homoloogsuse määramine • DNAde homoloogsust peegeldab ka hübriidse DNA sulamistäpp. • Kui see on alanenud vähe, võrreldes algsete DNAde sulamistäpiga, on järjestused sarnased. • Sulamistäpi muutust tähistatakse  Tm. • Tm ja DNAde suhteline homoloogsus korreleeruvad oma vahel hästi. Liigi piires peaks Tm olema kuni 5oC (sellele vastav DNA homoloogsuse % liigi piires on ca 70%).

  31. DNAde homoloogsuse määramine Ühte liiki kuuluvatel tüvedel on DNA homoloogsus 70% või enam. (Aga näiteks selle kriteeriumi alusel peaks inimene ja kõik primaadid kuuluma ühte liiki). Kui see homoloogsus on madalam, siis ei kuulu võrreldavad tüved samasse liiki. Ühte perekonda kuuluvatel liikidel peaks DNA homoloogsus olema 40-60%.

  32. DNAde homoloogsuse määramine DNAde homoloogsuse määramine on näiteks näidanud, et vana perekond Bacillus on heterogeenne: erinevate liikide vahel on DNA homoloogia 2-50%. Samal ajal on aga perekonnas ka homogeenseid gruppe. Üks homogeenne grupp on näiteks B. anthracis, B. cereus ja B. thuringensis.Nad on DNA hübridisatsiooni järgi 80-100% homoloogsed. Seetõttu on neid soovitatud kõik kanda liigi B. anthracis alla alamliikidena. Tegelikult võivad aga nad kõik olla tekkinud B. cereusest, omandades juurde virulentsusplasmiide. Nende kolme liigiga on sarnane ka B. mycoides.Ilmselt säilivad need liigid ikkagi iseseisvatena, sest nad on fenotüübiliselt hästi erinavad ja nende ühe liigi alla kandmine põhjustaks kindlasti segadust.

  33. DNAde homoloogsuse määramine Batsillide seas on ka teisi homoloogseid klastreid. B. amyloliquefaciens ja B. subtilis (mõlemad lagundavad tärklist) on 51-81% homoloogsed. Praegu ongi “vana” Bacillus perekonna baasil tehtud perekondi juurde. Näiteks Paenibacillus, kuhu on üle viidud B. polymyxa (nüüd Paenibacillus polymyxa), mis on ka perekonna tüüpliigiks. Perekonda Paenibacillus viidi üle ka teisi batsille: nüüd P. alvei, P. larvae, P. macerans, P. azotfixans, P. amyloloyticus jmt.

  34. DNAde homoloogsuse määramine Uute perekondade loomisel vana Bacillus perekonna liikide basil on avestatud spoori kuju, soolataluvust, raku kuju, peptidoglükaani koostist, rasvhapete ehitust, anaeroobsust/aeroobsust jne. Liigirikkam sugukonna Bacillaceae perekond on ikkagi Bacillus (>60 liigi). Aga see perekond on ikkagi veel heterogeenne ja arvatavasti luuakse tema praeguste liikide arvel veel perekondi juurde.

  35. DNAde homoloogsuse määramine Perekonnast Rhizobium on DNA homoloogsuse võrdlemisel osa liike eraldatud ja loodud nende jaoks uued perekonnad Sinorhizobium, Allorhizobium ja Mezorhizobium. Rhizobium meliloti Sinorhizobium meliloti Liigi kandmisel uue perekonna alla jääb liigiepiteet samaks!

  36. DNAde homoloogsuse määramine DNAde hübridiseerimise alusel on eemaldatud perekonnast Pseudomonas osa tüvesid ja viidud perekondade Comamonas ja Xanthomonas alla. Tehtud juurde veel perekonnad Burkholderia ja Ralstonia, millede alla viidi osa varem perekonda Pseudomonas kuulunud liike. Pseudomonas cepacia Burkholderia cepacia

  37. DNAde homoloogsuse määramine Perekonnast Streptococcus on eraldatud osa tüvesid ja kantud perekondade Lactococcus ja Enterococcus alla. Streptococcus lactis Lactococcus lactis Streptococcus faecalis Enterococcus faecalis

  38. Perekond Bacteroides, kes juba GC% alusel oli väga heterogeenne, on DNA homoloogsust arvestades lahutatud paljudeks erinevateks perekondadeks (kokku 12). Mõned näited neist uutest perekonadest on järgmisel slaidil toodud tabelis.

  39. Vana perekond Uued perekonnad Rühm kuhu nad praegu kuuluvad Bacteroides Bacteroides Bacteroidaceae Ruminobacter Gamma-proteobakterid Porphyromanas Bacteroidaceae Prevotella Bacteroidaceae Anaerorhabdus Cytophagales Rikenella Cytophagales

  40. DNAde homoloogsuse määramine DNAde hübridiseerimise järgi on väga lähedased (homoloogsus 80-89% ) enterobakterite perekonnad Escherichia ja Shigella. Seega võiks nende perekondade esindajad kuuluda DNA homoloogsuse kriteeriumi alusel kõik ühte liiki. Viimasel ajal koguneb ka üha enam andmeid, et patogeensuse poolest on need 2 perekonda ka sarnased. Mõlemad võivad kanda virulentsusplasmiide, mis kodeerivad enterotoksiine, shiga-taolist toksiini, adhesiine, siderofoore. Nende faktorite kombinatsioonist sõltub, kas mikroob põhjustab düsenteeriat, koolerataolist haigust, kõhulahtisust, uroinfektsiooni või veremürgitust.

  41. DNAde homoloogsuse määramine Seega tundub, et Shigella on auksotroofne, invasiooniplasmiide kandev, inimesega kohanenud E. coli. Oletatakse, et Shigella erinevad tüved on tekkinud korduvalt E. coli tüvede baasil, omandades uusi geneetilisi elemente, mis kannavad virulentsusfaktoreid.

  42. DNAde homoloogsuse määramine Samal ajal on näiteks erinevad Clostridium botulinum’i tüved DNA hübrdisatsiooni järgi ainult 10% sarnased ja palju sarnasemad teiste perekonna Clostridium liikide tüvedega. Aga kuna nad kõik sünteesivad botulismitoksiini, siis epidemioloogilistest kaalutlustest lähtudes ei soovitata neid teiste liikide koosseisu lülitada.

  43. rRNA geenide järjestuste võrdlemine 1965. a. arvasid Linus Pauling ja Emile Zuckerlandl, et biomolekulid võivad olla molekulaarsed kronomeetrid. Kümme aastat hiljem näitasid Carl Woese jt. , et 16SrRNA on üks selline molekulaarne kronomeeter.

  44. rRNA geenide järjestuste võrdlemine Praegune Bergey süstemaatikakäsiraamat ja suur koguteos “Prokaryotes” on oma fülogeneetilise süsteemi ehitanud üles just 16SrRNA järjestuste võrdlemisel. rRNA geenid on head evolutsioonilised markerid, sest nende järjestused on vähe muutunud. Ribosoom on väga oluline organell ja seetõttu elimineeritakse populatsioonist mutatsioonid, mis valgusünteesi tugevasti häirivad.

  45. rRNA geenide järjestuste võrdlemine Bakterite ribosomaalsete rRNAde ultratsentrifuugimisel eraldub 3 erinevat rRNAd: 23S, 16S ja 5S. Nende pikkused on 3300, 1650 ja 120 nt.

  46. rRNA geenide järjestuste võrdlemine Ajalooliselt sekveneeriti esmalt 5S rRNAd, sest ta oli kõige lühem ja hõlpsam sekveneerida.

  47. rRNA geenide järjestuste võrdlemine: 16SrRNA esimesed kataloogid Mikroobist eraldatud 16SrRNA restrikteeriti RNAse T1-ga. RNAse T1 on guanosiini kõrvalt lõikav ensüüm. 16SrRNA-st moodustus selle ensüümiga lõikamisel ca 500 oligot pikkusega kuni 20 nukleotiidi. Iga lõik, mis oli pikem, kui pentameer, sekveneeriti. Kasutati RNA radioaktiivset märgistamist ja kahedimensioonilist paberkromatograafiat. Lühemaid oligosid ei sekveneeritud, sest nende järjestus sisaldas liiga vähe infot. Saadi kataloog, mis koosnes ca 80 oligonukleotiidsest järjestusest.

  48. rRNA geenide järjestuste võrdlemine: 16SrRNA esimesed kataloogid Selle kataloogi järjestused olid ühtlaselt jaotunud üle kogu 16SrRNA geeni ja katsid sellest ca 35-45%. Kuigi rRNAd, mis isoleeriti kõrge GC%-ga bakteritest nagu deinokokid, aktinomütseedid ja paljud proteobakterid, andsid Rnase T1-ga lõikamisel rohkem fragmente, kui madala GC%-ga bakterite omad, olid paljud oligod heksameerist lühemad ja neid ei sekveneeritud. Madala GC%-ga mikroobide kataloogid olid informatiivsemad, sest sisaldasid rohkem pikemaid oligosid. Katalooge võrreldi omavahel, leiti sarnasuskoefitsiendid st. SAB, koostati maatriksid ja dendrogrammid.

  49. rRNA geenide järjestuste võrdlemine Kui vörrelda dendrogramme, mis on koostatud 16SrRNA oligonukleotiidide kataloogimise andmete pöhjal ja dendrogramme, mis koostati 16SrRNA pikkade löikude, vähemalt 1000 nukleotiidi, vöi täispikkade 16SrRNAde sekveneerimise alusel, siis olid need üpris sarnased. Näiteks mölema meetodiga eristusid iseseisvate höimkondadena Thermotoga rühm jaklamüüdiad.

  50. rRNA geenide järjestuste võrdlemine

More Related