Taxonomie bactérienne

1. Taxonomie bactérienne Ph Riegel Pharmacie

2. Définitions • Taxonomie: science de la délimitation des bactéries en groupes (familles, genres, espèces…). • Classification: attribution d’une identité à une bactérie après études taxonomiques et selon des règles appelées nomenclature • Identification: assimiler une bactérie à une espèce déterminée en fonction de caractères communs. • Phylogénie: science de l’évolution génétique dans le temps d’une bactérie parmi toutes les autres

3. Nom des bactéries • Une bactérie est définie par: • Le genre • 1ère lettre en majuscule • L’espèce • Pas de majuscule • Une bactérie est aussi incluse dans une famille et un ordre (en italique, 1ère lettre en majuscule) • Ex: Escherichia coli, famille des Enterobacteriaceae

4. Méthodologie • Classification phénotypique • Tests biochimiques: enzymes, assimilation, fermentation • Morphologie (Gram, forme, mobilité) • Structure de molécules: chimiotaxonomie (lipides, protéines) • Classification génotypique • Détermination de groupes génomiques • Détermination des filiations (évolution) par études phylogéniques

5. Classification phénotypique simple • Tests biochimiques simples et en nombre réduits (fermentation de sucres, utilisation de composés carbonés, caractères de croissance): • très subjectif (pour le choix des tests et leur lecture) • peu fiables (une mutation ponctuelle peut survenir).

6. Classification simple

7. Classification phénotypique complexe (1) • Taxonomie basée sur l’analyse d’un nombre important de caractères biochimiques • Plusieurs méthodes: • Méthode dite de « pas à pas », chaque caractère engendre une dichotomie dont l’aboutissement rassemble des souches avec tous les caractères communs. Mais risque d’erreur si une mutation • Analyse factorielle: chaque souche est positionnée dans un espace 2D des variables en fonction de ses caractères.

8. Classification numérique

9. Classification phénotypique, chimiotaxonomie • Étude de molécules qui résultent d’une série de réactions enzymatiques et donc de l’expression de plusieurs gènes (contre un seul pour de nombreux tests simples). • Paroi: • Acides gras, acides aminés, sucres • Membrane cellulaire • lipides • Cellule: • protéines

10. Bactéries Gram négatif

11. Bactéries gram positif

12. Paroi • Acides gras • Chaîne carbonée de 2 à 90 atomes présents dans le LPS (Gram -) ou paroi (Gram +) • Résistance à l’alcool et à l’acide pour des longueurs supérieure à 36 C • (coloration de Ziehl pour les mycobactéries (60-90 C) ou modifiée pour les Nocardia (36-60 C). Ces acides sont appelés acides mycoliques. • Détermination par CPG ou HPLC

13. Paroi • Peptidoglycanne: Polymères formés par des chaînes linéaires de N-acétylglucosamine et d’acide N-acétylmuramique, reliées entre elles par de courtes chaînes peptidiques composés d’acides aminés ou diaminés (ac diaminopimélique). Différences entre certains genres bactériens

14. Membrane • Lipides polaires • Ils sont présents dans les membranes cellulaires. • Détermination par chromatographie (CCM) • Différenciations de genres bactériens

15. Composés cellulaires • Protéines cellulaires: • Détermination des profils électrophorétiques de l’ensemble des protéines. Possibilité de révéler ensuite certaines protéines particulières (zymogrammes pour les enzymes, Western-Blot pour les antigènes)

16. Caractéristiques chimiotaxonomiques

17. Taxonomie génomique • Plusieurs approches, souvent complémentaires: • Étude du génome complet: • G+C % • hybridation ADN/ADN total • polymorphisme de restriction de l’ADN total • Séquençage du génome • Étude d’une portion du génome • Polymorphisme de restriction d’une portion d’ADN • Séquençage de gènes

18. G+C % de l’ADN • Composition en bases de l’ADN varie d’un organisme à l’autre (Chargaff, 1949). • G+C % = G + C / G + C + A + T (x 100) • Détemination: • Densité de l’ADN • Température de demi-dénaturation (Tm) • Chromatographie des nucléotides après hydrolyse complète de l’ADN: CCM, HPLC, électrophorèse capillaire • Variation entre 25 et 75 % entre les espèces, ne doit pas être différent de plus de 3 % à l’intérieur d’une espèce • Peu utile, phylogénie grossière: haut G+C %, bas G+C % pour les Gram +

19. G + C %, HPLC

20. G + C % valeurs

21. Hybridations ADN/ADN • « gold standard » pour la détermination des espèces. • Estimation de la similarité de deux ADN • même espèce: > 70 % • même genre: 1 à 60% • genres différents: < à 5 % • Possibilités d’évaluer la solidité des hybrides en mesurant les Tm de chacun des hybrides (homologues et hétérologues)

22. Hybridations ADN/ADN, principes

23. Autres techniques génomiques • Polymorphisme de restriction de l’ADN. • Des enzymes dits de restriction coupent l’ADN en des sites particuliers (de 3 à 6 nucléotides). • Il peut s’agir soit de l’ADN total, soit d’un fragment amplifié • Electrophorèse soit unidirectionnelle (petit fragment) soit pluridirectionnelle pour les gros fragments (champ pulsé). Des fragments différents reflètent des différence de nombre, de structure et de position de ces sites de restriction le long de l’ADN. • Cette technique peut être couplée à l’utilisation de sondes (ex ARN 16S et 23S ribosomiques dit ribotypage), limitant le nombre de bandes à l’électrophorèse

24. Polymorphisme de restriction Sans sondes Sonde rADN 16S

25. Polymorphisme de gène Exemple: • Polymorphisme de restriction du gène de l’ARN 16S ribosomique (ARDRA) • Amplification, action de l’enzyme puis électrophorèse

26. Séquençage de gènes et phylogénie • Utilisation de gènes « universels », c’est-à-dire présents chez toutes les bactéries • Gènes essentiels à la vie bactérienne dont les mutations sont rares et reflètent l’évolution lente des bactéries • Les plus utilisés: ARN 16S, rpoB, SDO, ATPase • La comparaison d’une séquence avec d’autres permet de décrire potentiellement de nouvelles espèces. • Cette comparaison permet aussi de placer une espèce (ou une souche) dans l’arbre de l’évolution, pour la définition des genres, familles et ordres.

27. Séquençage de gène

28. Séquençage, techniques

29. Comparaison de séquences • Interrogation par l’intermédiaire d’un site Internet ou d’un logiciel: • Inclusion de séquences proches (même genre) dans le logiciel • Détermination d’une séquence consensus • Comparaison avec cette séquence consensus et les autres • Modifications possibles en cas de doutes sur quelques bases

31. Comparaison de séquences, BLAST

32. Interprétation des séquences • Niveau d’homologies des séquences: exprimés en % d’homologie ou en % de divergences. • Actuellement, les seuls critères taxonomiques concernent la comparaison des gènes de l’ARN 16S: • Plus de 97,5 % d’homologie, même genre mais seulement possibilité de même espèce, faire des hybridations ADN/ADN. • Entre 90 et 97,5%: espèces différentes, a priori même genre, à conforter par chimiotaxonomie. • Moins de 90%: a priori genres différents • Pour les autres gènes: • étude phylogénétique • études taxonomiques pour des genres dont l’ARN 16S est très similaire

33. Interprétation en taxonomie moléculaire

34. Intérêts des méthodes taxonomiques

35. Construction d’arbres phylogéniques • Une fois que les séquences, forcément assez voisines sont alignées, on peut calculer des arbres phylogéniques reflétant les divergences successives au cours de l’évolution. • Un arbre phylogénique est caractérisé par sa topologie (sa forme) et la longueurs de ses branches. • Calcul de la robustesse des arbres: probabilité de retrouvé chaque nœud de l’arbre pour 100 recherches (bootstrap)

36. Arbre phylogénique

37. Stratégie d’identification bactérienne Souche inconnue Séquence ARN 16S, interrogation Internet 98, 5% < 98,5% Identification acceptée pas d’identification (sauf si atypique)nouvelle espèce?

38. Stratégie taxonomique Taxon connu mais très hétérogène Plusieurs groupes par taxonomie numérique Confirmation par hybridation ADN/ADN Séquence ARN16S des représentants >98,5% < 98,5 % Hybridation entre représentants nouvelles espèces