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School of life sciences Nantong University

School of life sciences Nantong University. 南通大学生命科学学院. 类囊体膜脂与植物低温敏感性关系的研究进展. Advances in research of the relationships between Thylakoid Membrane Lipids and chilling sensitivity in plants. 朱 素 琴. 引言.

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  1. School of life sciences Nantong University 南通大学生命科学学院 类囊体膜脂与植物低温敏感性关系的研究进展 Advances in research of the relationships between Thylakoid Membrane Lipids and chilling sensitivity in plants 朱 素 琴

  2. 引言 • 温度是植物赖以生长和繁衍的重要环境因子，也是决定植物在地球上分布的关键因素之一。按照对低温的敏感性，陆生植物可以分为抗冷性植物如菠菜(Spinacia oleracea)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)等，和冷敏感性植物如南瓜(Cucurbita moschata)、水稻(Oryza sativa L)等。 • 低温对植物生理代谢的影响已有长期的研究，自Lyons(1973)提出低温膜伤害假说以来，国内外学者已从不同的角度探讨低温膜伤害的机理。

  3. 就环境因素讲，低温、强光、干旱等外部环境的变化，引起细胞内过氧化氢酶(陈贻竹, 1988)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD) (林植芳等, 1984；王以柔等, 1986)活性等内部环境的变化，从而导致植物体内超氧阴离子、H2O2等积累，最终引起膜脂过氧化(伤害)和丙二醛(MDA)含量增加，而这些都与生物膜膜脂中脂肪酸的不饱和水平(王洪春等,1980)密切相关。 • 就研究的部位讲，整个生物膜系统包括膜结合蛋白质、脂类、多糖等均与低温膜伤害有关，而位于叶肉细胞中的类囊体膜及膜结合蛋白质、脂类、多糖等在低温膜伤害中的变化更引人关注。

  4. 类囊体膜脂主要含有: ●单半乳糖二酰基甘油(monogalactosyldiglyceride, MGDG)、 ●双半乳糖二酰基甘油(digalactosyldiglyceride, DGDG)、 ●硫代异鼠李糖甘油二脂(sulfoquinovosyldiglyceride, SQDG)、 ●磷脂酰甘油(Phosphatidylglycerol, PG)

  5. Lipid composition varies between organelles % o f t o tal a cy l li p id co nt e nt i nn er C h l oro p la st m i t o c ho nd ria l p la sm a G l yce r oli p i ds th yla k oi d m e mb ra n e m e mb ra n e M GD G 5 1% 0 0 D G DG 2 6 0 0 S QD G 7 0 0 P C 3 2 7 3 2 PS 0 2 5 0 P G 9 0 0 P E 0 2 9 4 6 P I 1 0 1 9 CL 0 2 0 0 Cardiolipin, CL 双磷脂酰甘油

  6. 研究类囊体膜脂与植物抗冷性关系倍受重视，概括起来主要进行了以下四方面的研究。研究类囊体膜脂与植物抗冷性关系倍受重视，概括起来主要进行了以下四方面的研究。

  7. 第一、通过改变类囊体膜脂组成来研究其功能。第一、通过改变类囊体膜脂组成来研究其功能。 • 用生物化学手段重组试验研究PG对菠菜光系统Ⅱ放氧活性的影响(阳振乐等, 2000), • 或在控制的条件下用磷脂酶处理类囊体膜中的PG，从而创造出脂类含量或组成不同的光合膜，研究脂类组成变化对类囊体膜光合功能的影响(Siegenthaler, 1998), • 通过膜蛋白与膜脂体外重组的方法，研究PG在LHC-Ⅱ三聚体形成中的作用(Dubertret , 1994)。

  8. 采用遗传学和现代分子生物学方法，通过抑制或过量表达脂肪酸或脂类合成酶基因，从而改变某个特定脂或脂肪酸在类囊体膜中的组成。如以乙基甲烷磺酸盐为诱变剂，获得拟南芥类囊体膜脂脂肪酸去饱和酶基因的系列突变体(Browse, 1994),或用RNA干扰技术(RNAi)特异地阻断拟南芥体内特定脂肪酸去饱和酶基因FAD2 (Stoutjesdijk et al，2002)、或棉花体内特定脂肪酸去饱和酶基因FSD2和SAD-1的表达(Liu 2002)，研究膜脂功能的变化。

  9. CH2－O－CO－R1 | | HC－O－CO－ R2 O－ CH2 CH2OH O O HO O OH H C C C C C C C C H H C C C C C HO OH C C C C C C C H CH3 HO C C C C C C C C C C C C CH3 第二，叶绿体类囊体膜膜脂不饱和度相关基因的研究 16:0 palmitic acid 棕榈酸, 十六酸, 软脂酸 18:1△9,oleic acid 油酸, 十八烯酸

  10. CH3 O C C C C C C C C O HO C C C C C C C C C C C C C C HO C C C C C C C C C C C C CH3 亚油酸, 罂酸, 十八碳二烯酸 18:2 △9, 12, linoleic acid 亚麻酸, 十八碳三烯酸 18:3 △9, 12,15, linolenic acid

  11. 脂肪酸合成途径是首先在质体基质中产生饱和脂肪酸（16:0和18:0）。脂肪酸合成途径是首先在质体基质中产生饱和脂肪酸（16:0和18:0）。 • 第一步去饱和反应是由硬脂酸（18:0）形成油酸，由位于质体基质中的硬脂酰－ACP 去饱和酶（stearoyl-ACP desaturase, SAD）催化完成(Ohlrogge and Browse, 1995)。 • 18:1和16:0是植物细胞在质体基质中合成的两种主要脂肪酸，它们形成甘油脂后，参与生物膜的构建。 • 在各种去饱和酶的作用下，内质网或叶绿体被膜中的甘油脂部分脂肪酸被还原，成为含多不饱和脂肪酸的甘油脂(Ohlrogge and Browse, 1995)。 图. 拟南芥叶绿体和内质网膜脂中多不饱和脂肪酸的生物合成 图中箭头的宽度代表通过不同步骤的相对流量，途径中的“打断”(红色)代表以下突变位点，且已从拟南芥中获得这些位点的突变体。 DAG：二酰甘油； DGD：双半乳糖甘油二脂； G3P：甘油-3-磷酸； LPA：溶血磷脂酸； MGD：单半乳糖甘油二脂； PA：磷脂酸； PC：磷脂酰胆碱； PE：磷脂酰乙醇胺； PG：磷脂酰甘油; PI：磷脂酰肌醇； SQD：硫代异鼠李糖基甘油二脂。

  12. CH2－O－CO－R1 | | CH3 O HC－O－CO－ R2 C C C C C C C O－ CH2 C HO C C C C C C C C CH2OH C O HO OH H H H OH H • ω-3脂肪酸去饱和酶是一种脂酰-脂去饱和酶，位于植物内质网膜、质体膜和兰藻类囊体膜上，其空间位置在sn-1或sn-2，作用位置在ω-3，以与载体结合的不饱和脂肪酸为底物，催化与甘油脂结合的二烯脂肪酸形成第三个双键。

  13. Kodama等(1994)将拟南芥叶绿体ω-3脂肪酸去饱和酶的基因fad7转至烟草，转化株不饱和脂肪酸C18:3和C16:3含量明显升高, 抗寒能力也随之增强。 • Murakami (2000)等使烟草中ω-3脂肪酸去饱和酶的编码基因沉默，导致突变植株的三烯脂肪酸比野生型植株明显减少，突变植株能更好的适应高温环境，而相应对低温环境的适应能力减弱。 • Wakita等(2001)将烟草微体ω-3脂肪酸去饱和酶的基因(NtFAD3)通过农杆菌介导转入甘薯中，发现转基因植株中C18:3的含量明显增加，同时，抗寒能力增强。

  14. 第三，植物冷驯化(cold acclimation)对叶绿体类囊体膜脂不饱和度和膜脂分子组成的影响 • 冷驯化是与提高植物抗冷性有关的生物化学及生理学过程，主要包括寒驯化(喜温植物在中度低温10-12℃下暴露数天后就能适应更低但非冰冻温度环境，cool acclimation)和冻驯化(在0℃以上处理植物，以提高它们耐受0℃以下环境的能力，freezing acclimation)两种类型。 • 在冷驯化过程中，植物感受低温信号之后，启动防御机制，包括物理结构适应(质膜组成改变和细胞骨架重排)、胞内渗透保护物质含量增加(可溶性糖、脯氨酸、甜菜碱等)、抗氧化剂的合成水平上升(如超氧化物歧化酶、过氧化物酶、抗坏血酸还原酶)，使植物体内重新恢复物质和能量代谢平衡，从而能够在温度更低的环境下存活。

  15. 膜脂分子组成 • 陈志强等（1994）研究发现：经低温锻炼后，抗寒与不抗寒品种小麦类囊体磷脂酰甘油(PG) 的反式十六碳一烯酸含量均明显降低；抗寒品种小麦的MGDG/DGDG比值明显降低, 而不抗寒品种变化不明显。 • 杨玲(2001)的研究发现，经冷驯化后黄瓜子叶中DGDG大量增加，MGDG含量变化不大。 膜脂不饱和度 • 具有耐冻性的野生土豆种经冷驯化后质膜磷脂不饱和度增加25%，而冷敏感的栽培种冷驯化后质膜磷脂不饱和度无明显变化(Palta et al, 1993)。 • 低温条件下，喜温植物雀稗草的三烯脂肪酸亚麻酸的含量明显升高，并且抗冷品种膜脂亚麻酸含量的变化大于中等抗冷品种和冷敏感品种(Cyril et al, 2002)。

  16. O CH2－O－CO－R1 | CH－O－CO－R2 | CH2－O C C C C C C C C HO C C C C C C C －O－ CH3 CH2 | | CH2OH CHOH O P C C C C C C C C HO C C C C C C C CH3 第四，类囊体膜PG分子组成与植物的抗冷性 • 类囊体膜脂磷脂酰甘油(PG)因具有较多的饱和脂肪酸和一种特殊的脂肪酸16:1(3t) 而被认为是一种对温度最为敏感、在降温过程中最先发生相变、从而影响膜流动性的分子(Murata N等,1983)，是一种涉及光合作用活动和植物抗寒性的重要磷脂。 16:1 trans △3,16:1(3t), 16:0 palmitic acid 棕榈酸, 十六酸, 软脂酸

  17. heat cool • PG是一种广泛存在于植物细胞膜中的磷脂，但主要分布在叶绿体类囊体膜中，虽只占类囊体膜脂的3%-10%，却是决定膜脂相变的主要因素(Murata N, 1983)。PG分子中高熔点分子(C16:0/16:0 + C16:0/16:1t)占总分子种的百分比，或饱和脂肪酸(C16:0 + C16:1t)占总脂肪酸的百分比与植物冷敏感性明显相关(Murata N, 1983. Tasaka, 1990)。 Phase transition of a lipid bilayer.

  18. 1 冷敏感植物叶片中PG分子饱和度比抗冷植物中的高 • 拟南芥因含有高比例的顺式不饱和脂肪酸而较抗冷，南瓜则因含低比例不饱和脂肪酸而冷敏感[19]。 • Murata等[20]分别将南瓜、拟南芥G3PAT基因导入烟草，结果表明转基因植株叶片中PG脂肪酸饱和度得到了明显的改变，转基因植物的抗寒性也发生了改变，转入冷敏感植物南瓜G3PAT基因的烟草，类囊体膜PG分子中饱和脂肪酸含量提高，因而抗冷力下降，对低温更敏感；而导入拟南芥G3PAT基因的烟草，PG分子中不饱和脂肪酸含量增加，抗寒性得到明显的提高。

  19. H2C－O－16:0 | HC－OH | H2C－ O－P 16:0－ACP 18:1－ACP G-3-P与16:0－ACP结合 H2C－OH | HC－OH | H2C－O－P G3PAT酶 H2C－O－18:1 | HC－OH | H2C－ O－P 16:0－ACP 18:1－ACP G-3-P与18:1－ACP结合 2 G3PAT酶的酰基选择性与类囊体膜脂中PG分子饱和度的关系 • 叶绿体中存在甘油-3-磷酸酰基转移酶(glycerol-3-phosphate acyl transferase,G3PAT)催化C16:0或C18:1(反应中C16:0或C18:1的载体是酰基载体蛋白ACP)与甘油-3-磷酸(G-3-P)分子中甘油基sn-1位上的-OH进行酯化反应。

  20. 18:1 16:0 G3PAT酶的酰基选择性 sn-1 sn-1 sn-1 sn-1 sn-1 18:2 16:0 18:1 18:3 sn-2 sn-2 sn-2 sn-2 sn-2 16:0 或16:1(3t) 16:0 或16:1(3t) 16:0 或16:1(3t) 16:0 或16:1(3t) 不饱和PG分子种 sn-3 sn-3 sn-3 sn-3 sn-3 P P P P P 饱和PG分子种 刚合成的PG初产物在sn-1位是18:1或是16:0，在sn-2位上是16:0 或16:1(3t)。

  21. H2C－O－18:1 | H C－OH | H2C－O－P H2C－O－18:2 | H C－OH | H2C－O－P H2C－O－18:3 | H C－OH | H2C－O－P 16:0-ACP 18:1-ACP H2C－OH | H C－OH | H2C－O－P 18:1/16:0 18:1/16:1(3t) 18:2/16:0 18:2/16:1(3t) 18:3/16:0 18:3/16:1(3t) G3PAT H2C－O－16:0 | H C－OH | H2C－O－P 16:0-ACP 18:1-ACP 16:0/16:0 16:0/16:1(3t)

  22. 3 G3PAT酶结构与G3PAT酶的酰基选择性的关系 • G3PAT酶蛋白分子中都有一个保守的“HX4D”模体(H, D分别为组氨酸和天冬氨酸，X4代表其它4种氨基酸)。定点突变证明，“HX4D”模体中组氨酸(H)的变化将导致该酶失去酰基转移的功能，推测该模体是该酶的催化中心。

  23. 南瓜G3PAT酶中假定的3-磷酸-甘油(G-3-P)结合位点(G-3-P分子中碳原子是白色、氧原子红色、磷原子粉红色)。南瓜G3PAT酶中假定的3-磷酸-甘油(G-3-P)结合位点(G-3-P分子中碳原子是白色、氧原子红色、磷原子粉红色)。 • G-3-P分子中的磷酸部分躺在His139(H139)、Lys193(K193) 、His194(H194)、Arg235(R235)、Arg237(R237)组成的带正电荷口袋里，甘油基的C1-OH在口袋中的方向与在丝氨酸蛋白酶中起催化反应的丝氨酸分子中的-OH方向相同，与来自H(X)4D模体中的His139(H139)和Asp144(D144)形成一个催化三联体(catalytic triad), 图中用蓝绿色标明。 • 该图用MIDAS PLUS(分子建模软件, 美国加利福尼亚大学旧金山分校计算机图形实验室开发)软件绘制，引自Turnbull等(2001)。

  24. 南瓜G3PAT酶中假定的脂酰基底物结合位点，结合位点部分显示了脂肪酸侧链的几种可能的构象。南瓜G3PAT酶中假定的脂酰基底物结合位点，结合位点部分显示了脂肪酸侧链的几种可能的构象。 • 脂肪酸链中的9个碳原子插在由12个氨基酸残基(图中用黑色表明)组成的5Ǻ 宽的口袋里， • 脂肪酸链末端的其余碳原子插在由14个氨基酸残基(图中用红色表明)组成的10Ǻ宽的口袋里。 • 另外，与结合G-3-P有关的7个氨基酸残基用黑色和方括号表示。 • 该图用MIDAS PLUS(分子建模软件, 美国加利福尼亚大学旧金山分校计算机图形实验室开发)软件绘制，引自Turnbull等(2001)

  25. 在冷敏感植物如南瓜中，C16:0/C18:1底物通过范德华力结合在由14个氨基酸残基组成的深的、很窄的疏水性“口袋”里，由于该“口袋”的口很小，酶分子对底物无选择性(即对C16:0或C18:1有同等的选择机会)。若扩大“口袋”的口，酶分子可优先选择底物C18:1。因为C16:0脂酰基是直的棒状构象，顺式结构的C18:1脂酰基是弯的棒状构象，且多两个碳原子。在冷敏感植物如南瓜中，C16:0/C18:1底物通过范德华力结合在由14个氨基酸残基组成的深的、很窄的疏水性“口袋”里，由于该“口袋”的口很小，酶分子对底物无选择性(即对C16:0或C18:1有同等的选择机会)。若扩大“口袋”的口，酶分子可优先选择底物C18:1。因为C16:0脂酰基是直的棒状构象，顺式结构的C18:1脂酰基是弯的棒状构象，且多两个碳原子。

  26. Slabas等(2002) 在南瓜中，将位于“口袋”口的第261位亮氨酸(Leu261)改换成另一个氨基酸，而使“口袋”口张大，改变了该酶的原有特性，变成优先选择底物18:1ACP，最后提高PG分子的不饱和水平。

  27. 已做的工作 • 在组成G3PAT酶深的、很窄的疏水性“口袋”的14个氨基酸残基中，籼粳稻之间有较大差异，这可能是引起籼粳稻G3PAT酶对18:1ACP/16:0ACP选择比值有差异的主要原因。

  28. sn-1 sn-1 sn-1 sn-1 sn-1 18:3 16:0 18:1 18:2 sn-2 sn-2 sn-2 sn-2 sn-2 16:0 或16:1(3t) 16:0 或16:1(3t) 16:0 或16:1(3t) 16:0 或16:1(3t) sn-3 sn-3 sn-3 sn-3 sn-3 P P P P P 已做的工作 18:1 16:0 G3PAT酶的酰基选择性 不饱和PG分子种 饱和PG分子种 研究证明：G3PAT酶的酰基选择性在籼粳稻间有差异

  29. 思 路 与 技 术 路 线

  30. Thank you

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