Dzīvnieku šūnu diferenciācija

1. Dzīvnieku šūnu diferenciācija

2. “Homeobox” saturoši gēni: • Kodē transkripcijas faktorus. • Proteīni satur domēnus, kas pievienojas pie DNS. • Darbojas noteiktā embrija zonā, atbilstoši novietojumam hromosomā. • Augiem ir analoģiski gēni, satur MADS-box

3. Cilvēkam novietoti 4 hromosomās

4. Global Analysis of mRNA Localization Reveals a Prominent Role in Organizing Cellular Architecture and Function Cell 134, 843–853, September 5, 2008 • Drozofilas embrionālā attīstība 4,5 stundas, stadijas 1-9. • mRNS FISH analīze, 25% Drozofilas genoma 3370 gēni

5. mRNS FISH analīze, 25% Drozofilas genoma 3370 gēni • 3214 gēni ekspresēti, • 2198 nāk no mātšūnas, • 504 ekspresēti zigotā, • 388 ekspresēti zigotā un mātšūnās. • Mātšūna dod 65% no zigotas mRNS!

7. 71% no gēniem ir noteikta lokalizācija.

9. orb: posteriorā puse, 3 stadijā ap kodoliem gredzenveida novietojums.71% no gēniem ir noteikta lokalizācija.mRNS-zaļa, kodols – sarkans.

10. Virspuse, 3 stadija. cno novietots šūnu perifērijā, anillin novietots gredzenveidā pie kodoliem. mRNS-zaļa, kodols – sarkans.

11. Virspuse, 1-5 stadija. raps novietots pie centrosomām. mRNS-zaļa, kodols – sarkans.

12. mRNS un proteīnu kolokalizācija. Proteīni, kas nosaka šūnu dalīšanos.. mRNS-sarkana, proteīni - zaļi, kodols – zils.

13. Embrionālās attīstības ģenētiskā regulācija

14. Augļu mušiņas attīstības īpatnības Augļu mušiņu olās gēnam bcd - “bicoid” - veidojas mRNS gradients. Ola saņem transkriptus no pavadītājšūnām. Transporta virziens un signāls RNS molekulas 3’ daļā nosaka augstu šo mRNS molekulu koncentrāciju anteriorajā daļā un zemu – pretējā pusē.

15. Augļu mušiņas attīstības īpatnības Pēc apaugļošanās sākas translācija. Izveidotā olbaltumviela ir atbildīga par kāpura galvas veidošanos. Savukārt olas pretējā pusē uzkrājas “nanos” olbaltumvielas, kuras ir atbildīgas par astes daļas veidošanos.

16. Augļu mušiņas attīstības īpatnības Vairāki eksperimenti parāda šo RNS molekulu nozīmi. No šūnas anteriorās daļas tika atdalīta citoplazma, kura saturēja daudz bcd mRNS. Tās vietā ievadīja ar “nanos” mRNS bagātu citoplazmu no citas šūnas. Rezultātā izveidojās kāpurs ar asti abos galos. Citā eksperimentā citoplazmu ar ‘nanos” mRNS aizvietoja ar “bcd” saturošu citoplazmu. Tika iegūts pretējs rezultāts – kāpurs ar galvām abos galos. Izveidoja arī transgēnas mušas, kuru gēnam, kas kodēja “nanos”, tika pievienota 3’ galā anteriorā novietojuma signālsekvence no bcd gēna. Tas lika “nanos” mRNS molekulām novietoties pretējā – anteriorajā pusē.

17. Augļu mušiņas attīstības īpatnības Normāls kāpurs. E.Teilor un R.Lehman. Transgēns kāpurs. E.Teilor un R.Lehman.

18. Augļu mušiņas attīstības īpatnības Abas olbaltumvielas darbojas kā transkripcijas faktori. Olbaltumviela “bicoid” ieslēdz gēnu “hunchback”, bet olbaltumviela “nanos” iepriekšminēto gēnu inaktivē. “Nanos” un “bicoid” darbības rezultātā izveidojas gēna “hunchback” gradients. Tas ekspresējas priekšējā daļā, bet tā ekspresija ir nomākta aizmugurē. Arī “hunchback” produkts ir transkripcijas faktors. Šo transkripcijas faktoru kombinācijas noteiktās embrija zonās regulē citu gēnu ieslēgšanos un izslēgšanos.

20. Augļu mušiņas attīstības īpatnības Gēns “pa pāriem trūkstošais” (“even-skipped” (eve)) tiek ekspresēts 7 no 14 augļu mušiņas segmentiem. Eve gēna promoteram ir piesaistīšanās vietas olbaltumvielām, kuras kodē “bicoid” (bcd), “hunchback” (hb), “giant” (gt), “Krüppel” (Kr). Gēna eve aktivācija tiek panākta ar “bicoid” un “hunchback” olbaltumvielu pievienošanu. Gēna eve represēšana tiek panākta ar “giant” un “Krüppel” olbaltumvielu pievienošanu. Attēls no: P.A. Lawrence and Blackwell Scientific Publications.

21. Proteīnu sadalījumam seko morfoloģijas maiņa. Krāsu robežas vietā veidojas rieva. http://www.princeton.edu/~wbialek/rome/ lecture1.htm

22. Augļu mušiņas attīstības īpatnības Vairākas vietas var kalpot gan transkripcijas faktoru, gan inhibēšanas faktoru pievienošanai. Tāpēc liela nozīme ir šo proteīnu koncentrācijām šūnā, jo tās nosaka, cik lielā mēra var ekspresēt eve gēnu. “Giant” un “Krüppel” augstā koncentrācija noved pie eve ekspresijas ierobežošanas un robežzonas izveidošanās. Trešajā joslā darbojas citi promotori, kas neļauj represēt šī gēna transkripciju. Tādējādi izveidojas regulējošu faktoru komplekss, kas rada atšķirības dažādu segmentu gēnu ekspresijā.

23. In vivo Imaging of oskar mRNA Transport Reveals the Mechanism of Posterior Localization Cell 134, 843–853, September 5, 2008 Agrīnā embrionālā attīstība bicoid, oskar (osk), and gurken

24. No 8-10 ovocīta atīstības stadijai osk mRNS pārvietojas no pavadītājšūnām (15 gab.) uz ovocīta posterioro daļu. • Proteīns oskar veido granulas un nosaka vēdera dobuma un dzimumšūnu veidošanos. • Pārvietošanos nosaka BicD, jo nodrošina saistību ar dineīnu un mikrocaurulītēm un pārvietošanos “-” gala virzienā.

25. 9. ovocīta atīstības stadija. osk mRNS pārvietojies no pavadītājšūnām uz oocīta posterioro daļu.

26. 9. ovocīta atīstības stadija. osk mRNSiezīmēta ar MS2-GFP. MS2-GFP satur kodola lokalizācijas signālu. Tāpēc redzams vai nu kodolos vai kolokalizēts ar osk.

29. Organismu diferenciācija Šūnu diferenciācija ir apskatāma kā visa organisma ontoģenēzes daļa. Sākotnējie impulsi nāk no gēniem, kas bija ekspresēti mātes organismā, t.i., mRNS, un olbaltumvielas, kas atradās jau neapaugļotā olšūnā. Tālākie etapi ir atkarīgi no zigotas gēniem, bet vēlāk arī no kaimiņu šūnu mijiedarbības.

30. Organismu diferenciācija Diferenciāciju var apskatīt, atbilstoši organisma un šūnu izmaiņām, embrionālās attīstības gaitā. Dzīvniekiem var izdalīt četras embrionālās attīstības stadijas: • drostalošanās, • formas veidošana, • diferenciācija, • augšana.

31. Drostalošanās Zigotas mitoze un citokinēze veido daudz mazu šūnu. Katrai no tām ir genoms, kas ir identisks zigotas genomam. Drostalošanās beidzas ar blastulas (blastocistas) veidošanos. Šajā fāzē šūnas organizējas slāņos.

32. Formas veidošana Formas veidošanas procesā parādās organisma priekšpuse un aizmugure (posteriorā un anteriorā puse), vēderpuse un mugurpuse (dorsālā un ventrālā puse), labā un kreisā puse. Gastrulācijas gaitā izveidojas sekojoši cilmšūnu slāņi: ektoderma, mezoderma un endoderma. To veidošanos nosaka zigotas gēnu ekspresija. Formas veidošanas stadijā nav redzamasmorfoloģiskas atšķirības starp šūnām. Dažādām šūnu grupām atšķiras regulējošo olbaltumvielu veidi, kas noteiks tālāko šūnu attīstību.

33. Audu diferenciācija Šajā etapā embrija šūnas diferencējas, t.i., veido daudzšūnu struktūras un iekššūnas struktūras, kas ir tipiskas pieaugušam organismam. Veidojas neironi, muskuļu šūnas, asins šūnas u.c. Tās apvienojas audos, audi – orgānos un orgāni – orgānu sistēmās.

34. Diferenciācija

35. Cilvēka embrionālā attīstība

36. Cilvēka embrionālā attīstība Ektoderma – epidermālais epitēlijs, nervu audi Entoderma – entodermālais epitēlijs Mezoderma – endotēlijs, balstaudi, saistaudi, asinis

37. Cilvēka embrionālā attīstība un audu veidošanās problēmas. • Classic debates in all of developmentalbiology: where and when do endothelial cells (and hence bloodvessels) arise in the developing embryo? • Because blood vesselsare first observed in the yolk sac in avian and mammalian embryos,it was initially assumed that all blood vessels arise from extraembryonictissues. • Histological analysis subsequentlyindicated that isolated foci of endothelial cells can also beobserved in the embryo proper, which suggested that blood vesselsarise from an intraembryonic source (specifically, the mesoderm)rather than via colonization. Ferguson, J.E. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:2246-2254

38. Vasculogenic "hot-spots" in the mouse embryo. dpc, days post coitus; YS, yolk sac (orange); Al, allantois (purple); PPS, posterior primitive streak (green); PE, pro-epicardium (red); AGM, aorto-gonad-mesonephros region; PAS, para-aortic splanchnopleure. Ferguson, J.E. et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol 2005;25:2246-2254

39. Šūnu diferenciācija • Process, kurā embrionālās šūnas kļūst atšķirīgas (atšķirīga morfoloģija un funkcijas). • Saistīta ar dažādu šūnu tipu (audu) parādīšanos: muskuļaudi, ervaudi, taukaudi, segaudi. • Saistīta ar noteikta nemainīga terminālā šūnu tipa izveidošanos. (morfoloģija un funkcijas nav pārejošas)Gēnu ekspresija izmainās un notieks specifisku proteīnu sintēze. • Šūnai parādās specifisks olbaltumvielu profils. Pirmais šūnu diferenciācijas etaps ir tad, kad tiek noteikts šūnu attīstības virzienu grupa.

40. Diferenciācija • Parāda in vivo raksturīgo fenotipu (šūnas morfoloģija) • dažkārt reversabla • pakāpeniska notikumu secība šūnu kultūrās nepieciešams inducēt. • Adaptīva - var regulēt • Terminālā diferenciācija - šūna pakāpeniski izmainās līdz izveidojas noteikts nemainīgs fenotips (neirons) var atrast marķierus (proteīnus), kas ir specifiski noteiktam šūnu tipam. • Dediferenciācija • audzējot kultūrā izzūd šūnu tipam raksturīgais fenotips

41. Diferenciācija ir neatgriezeniska šūnu pārveidošanās no cilmšūnām par vienu noteiktu šūnu tipu.Iespējami divi gadījumi: • 1. Audi, kuru šūnas bieži dalās (asinis, āda) • Totipotentas vai Pluripotentas cilmšūnas dalās (proliferācija) un sasniedz terminālas diferenciācijas gaitā noteiktu morfoloģiju ar noteiktām funkcijām un nespēj dalīties. • 2. Audi, kuru šūnas selektīvi dalās (trauma) • Miera apstākļos audos nav novērojama šūnu proliferācija • Noteiktos apstākļos (ievainojuma gadījumā) šūnas zaudē specializāciju, atkārtoti ieiet dalīšanās ciklā un strauji dalās līdz sasniegts nepieciešamais šūnu skaits. Tad dalīšanās apstājas un atkal notiek diferenciācija.

42. Diferenciācija progresē vienā virzienā • Ja šūna ir uzsākusi diferenciāciju vienā virzienā, tad tā nevar uzsākt diferenciāciju citā virzienā. • Leikocītu diferenciācija un eritrocītu diferenciācija • Ja izmaiņas izdara pietiekami agrīnā etapā, tad iespējama diferenciācijas virziena maiņa. • Izņēmums ir vēža šūnas • plaušu karcinomas šūnas izveido plakanā epitēlija karcinomas šūnas • grūti izsekot vēža šūna difernciācijas virzienam

43. Proliferācija un diferenciācija • Aktīvas proliferācijas gadījumā ir neliela diferenciācija • Neaktīvas proliferācijas gadījumā ir aktīva diferenciācija • Vēžu šūnas ir izņēmums

44. Pluripontenta cilmšūna - var diferenciēties dažādos virzienos • Unipotenta cilmšūna - nodrošina viena veida šūnu līnijas pastāvēšanu • Dediferenciēta šūna - diferencēta šūna pārvēršas par nediferenciētu, atsāk proliferāciju, atsāk to pašu terminālo diferenciāciju • Jo precīzāku barotni izmanto, jo precīzāk var kontrolēt šūnu proliferāciju un diferenciāciju

45. Diferenciācijas regulācija Šķīstoši inducētāji • fizioloģiski • hormoni (hidrokortizons, glukogāns, tiroksīns) • interleikīns un interferons • Vitamīni (D) • Joni (Ca 2+) • nefizioloģiski • dimetilsulfoksīdi (DMSO) • citotoksiski savienojumi (mitomicīns C)

46. Šūnas-šūnas mijiedarbība homoloģiskas šūnas • liels/mazs šūnu blīvums • spraugveida kontaktzonas un sekundārās signālmolekulas (mesendžeri) heteroloģiskasšūnas • starp šūnām kas radušās no viena veida embrionālajiem audiem

47. Šūnas-matriksa mijiedarbība • šūnas sekretē un izveido ļoti specifisku matriksu • no matriksa veida ir atkarīga gēnu ekspresija šūnās • grūti izveidot mākslīgi tādu matriksu, kas izraisītu vēlamās šūnu izmaiņas • ļoti liela atkarība no specifisku glikoproteīnu struktūras • matrikss izmaina dažādu augšanas faktoru aktivitāti

48. Šūnu forma un polaritāte • Šūnai nepieciešams uztvert virsmu kā bazālo vai apikālo. • Ja kultūrā ir plakanas šūnas, tad tām jāpārvēršas par kubiskām vai cilindriskām. • Dažiem receptoriem nepieciešams noteikts novietojums. • Nepieciešamība pēc vielu sekrēcijas noteiktā virzienā.

49. Diferenciācijas veicināšana šūnu kultūrā • Nepieciešams pareizas izolācijas apstākļos atdalīts noteikts šūnu tips, kas atrodas atbilstošā vidē. • Jāiegūst liels šūnu blīvums uz atbilstoša matriksa • Barotnes sastāvam jāstimulē diferenciācija vairāk nekā proliferācija. • Atbilstoši diferenciāciju izraisoši aģenti • Jāpievieno tie šūnu tipi, kas veicina diferenciāciju. (šūnas-šūnas mijiedarbība) • Laiks: inducētāji nepieciešami noteiktos diferenciācijas etapos uz noteiktu laika periodu.

50. Šūnu diferenciācijas ģenētiskā regulācija • Gēnu aktivitātes sistēmu diferencētā šūnā var noteikt divi faktori: 1) Ģenētiskā materiāla zudums. 2) Hromatīna modifikācijas. 3) Regulatorolbaltumvielas (transkripcijas faktori, u.c.)