CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni)

1. CORSO di ORGANISMI TRANSGENICI Sara Caldarola Lab 4306 (studio 4317 Prof Loreni) sara.caldarola@uniroma2.it ORARIO di RICEVIMENTO: Mercoledi 11:00-12:00

2. ANIMALI TRANSGENICI : definizione Animali transgenici: animali ottenuti attraverso una manipolazione del genoma, inserendo uno o più geni, appartenenti alla stessa specie, o più spesso di specie diverse.

3. ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo GFP

4. VETTORI RETROVIRALI • Permettono il trasferimento e l’integrazione • di materiale genetico nella cellula ospite

5. Vantaggi dei vettori non virali • Impossibile la generazione di nuovi virus patogeni • Riduzione del rischio di reazione immunitaria • Possono trasferire molti tipi diversi di molecole, e permettono di trasdurre molecole di DNA anche molto grandi • Possibilità di produzione in grandi quantità a basso costo Svantaggi dei vettori non virali • Scarsa efficienza sia di trasduzione che di integrazione • Se integrati possono a loro volta dare mutagenesi inserzionale Vantaggi dei vettori virali • Alta efficienza di trasduzione Svantaggi dei vettori virali • Possibilità di generare nuovi virus patogeni per ricombinazione con eventuali virus presenti nell’ospite • Mutagenesi inserzionale (per quelli che si integrano in maniera casuale nel genoma) • Molecole di DNA di dimensioni limitate • Reazioni immunitarie • Costi elevati

6. VETTORI VIRALI

7. Ciclo vitale di un retrovirus • genoma a RNA, 2 copie • L’enzima trascrittasi inversa converte l’RNA in DNA a doppio filamento nel citoplasma della cellula infetta. • Il DNA lineare migra nel nucleo e viene integrato nel DNA della cellula ospite. Il DNA integrato è chiamato provirus. • L’apparato della cellula ospite trascrive il provirus producendo RNA virali che fungono sia da mRNA che da genomi che saranno impaccati nei nuovi virioni. • 2 copie di RNA genomico vengono incapsidate in ogni virione

8. Genoma retrovirale Trascrittasi inversa e integrasi Proteina strutturale capside Proteina per involucro Psi + non codificante. Per confezionamento nel capside Lunga sequenza terminale ripetuta Vettore retrovirale Inserito nelle cellule eucariotiche con bassissima efficienza tramite trasfezione/elettroporazione Con alta efficienza Mediante INFEZIONE Lunghezza massima: 8Kb

9. Le particelle virali prodotte sono difettive per la replicazione • Possiedono un gene marcatore selezionabile (NeoR) • Infettano facilmente cellule in attiva replicazione • Si integrano stabilmente nel genoma ospite e producono il geneX INFEZIONE DI CELLULE IN COLTURA E PRODUZIONE GENE X

10. Packaging cell lines Linee cellulari transfettate stabilmente con geni virali codificanti per proteine strutturali del capside (late genes), necessarie per l’assemblaggio dei virioni. La loro transfezione transiente con il DNA-vettore determina l’impacchettamento del costrutto nel virione. Si ottiene in questo modo un vettore virale di transfezione completo.

11. Utilizzo vettori retrovirali: TERAPIA GENICA Tecnica terapeutica in cui un gene funzionale viene inserito nelle cellule somatiche di un paziente Scopo: • Correggere un difetto genetico • Fornire una nuova funzione alla cellula Applicabilità: 1. Malattie genetiche classiche (un solo gene coinvolto, ereditarietà mendeliana) 2. Malattie multigeniche (cancro) 3. Malattie genetiche acquisite (AIDS) 4. Malattie non genetiche 80% dei protocolli coinvolge malattie delle categorie 2-4

12. Caratteristiche del vettore ideale per la TERAPIA GENICA • Efficiente (trasdurre un numero di cellule elevato). • Dovrebbe garantire una prolungata produzione della proteina terapeutica (a livelli adeguati). • Capace di incorporare DNA di varie dimensioni. • Dovrebbe garantire la regolazione (trascrizionale, traduzionale o post-traduzionale) dell’espressione del gene terapeutico • Non dovrebbe essere patogeno. • Amministrabile direttamente nel paziente. • In grado di raggiungere specificamente le cellule bersaglio. • Ben tollerato. • Non dovrebbe avere componenti che inducono risposta immune. • Facile da produrre in maniera riproducibile. IL VETTORE IDEALE NON ESISTE. IL VETTORE PIU’ UTILIZZATO OGGI E’ IL VETTORE RETROVIRALE

13. ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo YAC GFP

14. 2) MICROINIEZIONE del DNA Gli organismi transgenici possono essere ottenuti modificando cellule embrionali totipotenti mediante iniziezione di materiale genetico

15. Stimolazione della ovulazione delle femmine donatrici (da 5 a 35) Dopo accoppiamento gli ovuli fertilizzati sono microiniettati con DNA lineare contenente il transgene (circa 200 copie) all’interno del pronucleo maschile Gli ovuli microiniettati (25-40) vengono impiantati in una madre adotttiva resa pseudogravida da maschio vasectomizzato. Dopo 3 settimane progenie e analisi. Accoppiamento e analisi progenie per capire se integrazione è nella linea somatica o germinale

16. Il gene inserito viene integrato nel genoma della cellula uovo che viene trapiantata in una madre adottiva , che darà origine alla nascita di un topino “chimera” (mosaico di cellule con patrimoni genetici diversi). Nella fase successiva si effettua un incrocio riproduttivo tra il topino chimera e un topo normale con la nascita di topini con i nuovi geni ma eterozigotici; solo nell’incrocio successivo tra i precedenti avremo la nascita di topini omozigotici per il gene introdotto

17. EFFICIENZA DELLA MICROINIEZIONE DEL DNA Al max 5% degli ovuli inoculati genera prole transgenica!!!

18. ANIMALI TRANSGENICI : come si producono??? Vettori retrovirali Microiniezione del DNA Cellule staminali embrionali Gene targeting/ gene trap KO condizionali Trasferimento del nucleo GFP

19. 2) Cellule staminali embrionali (ES cells) Le cellule ES sono cellule embrionali totipotenti, infatti possono dare origine a cellule di tessuti differenti. Le cellule ES vengono prelevate dalla massa cellulare interna della blastocisti(cellula embrionale indifferenziata) e mantenute in coltura in presenza di cellule o fattori che ne impediscono il differenziamento. In queste condizioni le cellule ES mantengono intatta la loro capacità di differenziarsi in modo appropriato in qualunque tessuto, una volta reintrodotte in un embrione

24. CALCIO FOSFATO • Il DNA a contatto con una soluzione di fosfato di calcio forma dei precipitati i quali, con un meccanismo poco noto (probabilmente per endocitosi) entrano nelle cellule • LIPOSOMI • Lipidi che permettono la formazione di vescicole liposomiali • Il DNA all’interno entra nella cellula mediante fusione vesciola-membrana Integrazione Sito specifica RICOMBINAZIONE OMOLOGA • ELETTROPORAZIONE • Scarica elettrica che altera la permeabilità della membrana generando • “buchi” e permettendo l’entrata di DNA esogeno IDENTIFICAZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto SELEZIONE POSITIVA/NEGATIVA PCR

25. SELEZIONE POSITIVA-NEGATIVA cellule ES Seq di DNA per RICOMBINAZIONE OMOLOGA nel genoma bersaglio TRANSGENE di interesse Gene che conferisce resistenza alla G418 Geni della Timidina Kinasi (virus herpes simplex). In presenza di GANCICLOVIR: MORTE

26. SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA ASPECIFICA SPECIFICA • Aggiunta di G418: SELEZIONE POSITIVA di cellule che hanno INTEGRATO il DNA • Aggiunta di GANCICLOVIR: SELEZIONE NEGATIVA di cellule con INTEGRAZIONE ASPECIFICA

27. METODO della SELEZIONE POSITIVA e NEGATIVA non è infallibile ma ARRICCHISCE la popolazione delle ES cells in elementi con TRANSGENE integrato nel sito CORRETTO

28. PCR SPECIFICA ASPECIFICA

29. Il GENE TRAPPING • 1) Consente l’isolamento di nuovi geni • 2) Consente la determinazione del profilo di espressione del gene intrappolato • 3) È mutagenico: produce knockout X-gal staining of E9.5d embryo showing reporter gene expression associated with a secretory trap insertion in a novel gene. Courtesy K. Pinson

30. STRATEGIA DEL GENE TRAP Scelta opportuna del vettore e del sistema di trasferimento Selezione dei cloni tramite “marker” Localizzazione dell’inserto nel clone selezionato ANALISI DEL FENOTIPO

31. ELEMENTI necessari per gene trap: • Cellule staminali embrionali di Topo o Uomo • “Entrapment vector” contenente : • - gene reporter • - marker di selezione

32. Cellule staminali embrionali di Topo Integrazione Sito specifica SELEZIONE di ES CELLS con TRANSGENE integrato nel sito corretto

33. Geni reporter • The E.colilacZ gene (produzione di beta-Gal) • The firefly luciferase gene • The jelly fish green flourescence protein (GFP) gene “Lac Z staining”: colorazione istochimica che rivela la presenza della beta-galattosidasi. Questo enzima, in presenza del substrato X-Gal, produce un prodotto insolubile di colore BLU. Questo metodo visualizza la presenza della beta-galattosidasi sia nell’organo “in toto” sia in specifici tessuti/cellule.

34. Elementiimportanti per espressionedi un gene e utilizzati per il GENE TRAPPING Enhancer corte sequenze che stimolano l’attività trascrizionale di un promotore Promotore combinazione di elementi ai quali si lega l’RNA polimerasi per iniziare la trascrizione di un gene

35. Vettori utilizzati per il GENE TRAPPING • Enhancer trap Vector • Promoter trap V. • Gene trap V.

36. Enhancer Trap Vector Promotore e pA INDIPENDENTI Endogenous gene X P' lac Z neo Promotore MINIMO pA pA Exon 1 Exon 2 Exon 3 Enhancer Vector Integration DNA lac Z neo Promotore MINIMO lac Z neo RNA PROTEIN X β-gal NeoR protein

37. Vector Promoter Trap Endogenous gene X Promotore e pA INDIPENDENTI PROMOTORE Promotore ASSENTE P' lac Z neo pA pA Vector Integration DNA neo lac Z RNA neo lac Z protein PROTEIN X β-gal NeoR

38. Gene Trap Vector Promotore e pA INDIPENDENTI Endogenous gene X P' Promotore ASSENTE neo lac Z SA pA pA Introne gene X Vector Integration neo lac Z SA DNA Spliced transcript neo lac Z RNA SA NeoR PROTEIN X protein β-gal Distruzione GENE X e ANALISI ESPRESSIONE

40. RICAPITOLANDO………….. • Il GENE TRAPPPING consente • Identificazione NUOVI GENI • Produzione di TOPI TRANSGENICI (KO) • ANALISI dell’ESPRESSIONE di GENI