Ubikvitinový systém pro degradaci proteinů a některé z jeho funkcí při kontrole BC

1. Ubikvitinový systém pro degradaci proteinů a některé z jeho funkcí při kontrole BC • 1937 Karcag, Maďarsko • 1950 Izrael • Faculty of Medicine at the Technion in Haifa • 2004 Nobelova cena za chemii AVRAM HERSHKO

2. University of California, San Francisco • Mechanismus indukce syntésy tyrosin-aminotransferasy (TAT) vlivem steroidních hormonů v kultivovaných jaterních buňkách • Degradace TAT (1969-71) Gordon Tomkins • 1939 izotopové značení 15N-Leucin • Méně než 1/3 izotopů nalezeno v moči => většina zabudována do proteinů tkání • Stálá váha zvířat – dynamická výměna proteinů • Degradace abnormálních a poškozených proteinů Rudolf Schönheimer (BRD, 1898-1941)

3. První pokus • Výměna média – rychlý pokles • Poločas rozpadu 2-3h • Degradace zastavena inhibitory tvorby energie v buňce (KF a další) • Potvrzovalo studii Simpsona o spotřebě En. při uvolňování AMK z proteinů v játrech • Nepřímý důkaz, En. nutná pro udržení kyselého pH v lysozomu • Pohlcení lysozomem ne, degradace TAT vyžaduje specifický enzym • Spotřeba ATP ( neobvyklý proces – existence intracelulárního proteolytického systému)

4. Hledání příčin potřeby energie v Izraeli • Využití klasické biochemie • Reakce buněčných lyzátů ve zkumavkách věrohodně reprodukující procesy • Frakcionace a oddělování komponent • Čištění a charakterizace komponent • Rekonstrukce systému z izolovaných přečištěných jednotek Joseph Etlinger • Proteolytický systém z lyzovaných retikulocytů závislý na ATP (1977) Alfred Goldberg Proerytroblast → Basofilní erytroblast → Polychromatofilní erytroblast → Ortochromatický erytroblast → Retikulocyt → Erytrocyt

5. Izolace a charakterizace komponent ATP-dependent proteolytic system from reticulocyt lysates Irvin Rose • Rozdělení lyzátu do 2 frakcí na diethylaminoethyl (DEAE-) celulóze • Frakce 1 obsahuje látky neadsorbované - hemoglobin (vyčištění) • Frakce 2 uvolněná solným roztokem, obsahuje nehemoglobinové proteiny • Samostatně frakce nejevily aktivitu, opětovnou kombinací počala ATP-dependentní degradace • Aktivní složka ve frakci 1 byla malá, teplotně stabilní molekula • Pojmenovaná APF-1 (ATP-dependent Proteolysis Factor 1) • Identita APF-1 a ubikvitinu potvrzena 1980 Wilkinsnem Aaron Ciechanover

6. Ubikvitin – funkce a vazba • První izolace Goldsteinem při zkoumání hormonů brzlíku • Postupně objeven ve všech tkáních a všech eurkaryotických organismech (ubiqity = všudypřítomný) • Funkce neznámá • Malá molekula z frakce 1 = domněnka regulační podjednotky neznámého enzymu z frakce 2 • Radioaktivně označený ubikvitin byl přidán k frakci 2 za přítomnosti i nepřítomnosti ATP • Gelovou chromatografií bylo zjištěno spojení s velkou vysokomolekulární látkou • Navázán kovalentní peptidovou vazbou • Ubikvitin se váže na velké množství proteinů (SDS-page)

7. Ubikvitin označený 125I byl inkubován s neoznačenými lysozomy a naopak a po rozdělení • Ubikvitin se váže na substrát, který má být rozložen ATP-dependentním proteolitickým systémem (např. lysozomem)

8. Původní předpoklad

9. Jak je ubikvitin navázán na proteiny? 10 let práce, podstata návrhu správně Sled 3 enzymů – E1: ubikvitin aktivující – E2: přepravce ubivitinu – E3: ubikvitin ligasa

10. Funkce enzymů • E1 zajistí aktivaci karboxylového konce glycinového zbytku ubikvitinu pomocí ATP a následuje připojení aktivovaného ubikvitinu do thiolového vazebného místa enzymu E1 thioleserovou vazbou • Transacylací je aktivovaný ubikvitin přesunut do SH místa enzymu E2, který přenese ubikvitin až k – NH2 skupině cílového proteinu • Navázání na protein probíhá pomocí enzymu E3, který je substrátově specifický • Velký počet E3 enzymů

11. Proteiny s navázanými řetězci ubikvitinů jsou rozloženy v proteozomovém komplexu (26S) • Ubikvitin je uvolněn ubikvitin-C-terminální hydrolasou nebo isopeptidasou http://plantsubq.genomics.purdue.edu/plantsubq/images/26S_Proteasome.png

12. Mechanismus degradace cyklinu B a objeveni APC/C komplexu 1990 Jak je degradace specifických buněčných proteinů obstarávána ubikvitinovým systémem v selektivních a regulovaných dějích? Cyklin B • - Pozitivně regulující jednotka Cdc2 (Cdk1) • - Komplex Cdk1-cyklin B = MPF, podporuje vstup do mitosy • - Inaktivace MPF = degradace cyklinu B, nutné pro opuštění mitosy • Jaký je systém degradace cyklinu B a proč pouze na konci mitosy?

13. Spisula solidissima (Surf clam) • Produkce velkého počtu oocytů • Luca a Ruderman vytvořili bezbuněčný systém z oplozených oocytů, který reprodukoval specifická stádia BC degradace mitotických cyklinů • Pomoc Roberta Palazza, Leonarda Cohen, Joan Ruderman. Joan Ruderman (USA) Frakcionace systému prokázala výskyt dvou komponent důležitých pro navázání ubikvitinu k cyklinu B (E2-C, E3-like activity) E3-like activity: 1500 kDa komplex, který váže ubikvitin na mitotické cykliny, oscilující v BC, inaktivní v interfázi a aktivní na konci mitosy. K aktivitě potřebuje přítomnost MPF (Cdk1-cyclin B).

14. Název ubikvitnové ligasy cyklosom • Podobná zjištění: • Kirschner team – Xenopus eggs • Anaphase-Promoting Complex • Nasmyth team – Yeast • Anphase-Promoting Complex / cyclosome = APC/C • Degradace mnoha regulátorů BC • (securin – inhibitor počátku anafáze) • Kontrolní bod dělícího vřeténka (dovoluje rozchod chromatid pouze po řádném připojení na vřeténko)

15. Degradace Cdk inhibitoru p27Kip1 • p27 způsobuje zastavení buňky v G1-fázi, • zabraňuje vstupu do S (inhibuje Cdk2-cyklin A • a Cdk2-cyklin E) • p27Kip1 univerzální inhibitor pro všechny • cyklin-Cdk komplexy • Prokázána degradace p27 ubikvitinovým systémem Michele Pagano • Pokusy pro identifikaci ubikvitin-ligasového systému označujícího p27 k degradaci, in vitro na HeLa buňkách • p27 se vázal na uvikvitin v extraktu rostoucích buněk více než v buňkách „uzamčených“ v G1 • Prokázána nutnost fosforylace p27 na T187, komplexem Cdk2-cyklin E pro ligaci p27-ubikvitin in vitro => kompetentní systém in vitro se stejnými pochody jako in vivo • Identifikace enzymu E3 – ubikvitinové ligasy • Přepoklad nutné přítomnosti SCF (Skp1-Cullin1-F-box protein) kvůli fosforylaci p27 substrátu

16. SCF komplexy • velká rodina ubikvitin-protein ligáz • variabilní F-box podjednotka rozpoznává příslušný fosforylovaný proteinový substrát Objev Skp2 proteinu (S-phase kinase-associated protein 2) = specifický F-boxu pro SCF, který připojuje ubikvitin k p27

17. Navázání ubikvitinu na p27 • Vyvázání Skp2 protilátkou z extraktu proliferujících buněk = zrušení vazné aktivity p27-ubikvitin • Dodaná rekombinantní vyčištěná Skp2 kompletně obnovila navázání ubikvitinu na p27 • In vitro důkaz: vazba p27 na Skp2 závisí na fosforylaci p27 na T187 (In vivo popsal Pagano lab) => Skp2 je specifický a limitující faktor SCF komplexu, který předurčuje p27 k degradaci • Oscilace Skp2 v BC: v G1 velmi nízký, roste před vstupem do S a dále jen klesá

18. Pokus o sestavení komlexu z jednotlivých komponent (Cullin, Skp1,Skp2, Roc1, Cdk/cyclin E, E1 a E2) • Chyběla Cks1 (cyklin kinase subjunit 1) • Patří do konzervativní rodiny proteinů Suc1/Cks, jako jediný z rodiny váže Cdk k fosforylovanému proteinu • Pro regulaci BC nezbytná

19. Rodina Suc1/Cks a Cks1 • Pouze Cks1 podmiňuje vazbu p27-ubikvitin v uměle poskládaném systému přečištěných komponent • Ostatní Suc1/Cks proteiny mají vazebná místa pro Cdk a aniontové vazebné místo • Cks1 se dokáže navázat na Skp2 a podporuje spojení Skp2 s fosforylovaným p27 na T187 • Cks1 má tři vazebná místa, všechna nutná k asociaci Skp2 na T187-fosforylovaný p27

20. Apeluje na propojení genetiky s biochemií!