Áthelyeződő genetikai elemek

1. Áthelyeződő genetikai elemek • Transzpozon terminológia • Inzerciós szekvenciák • Transzpozonok kimutatása baktériumokban • Bakteriális transzpozonok típusai • Transzpozíció (áthelyeződés) • Transzpozonok kivágódása • A transzpozonok hatása a baktérium genomra • Mu fág • A transzpozonok és az evolúció

2. Genetikai, fizikai térképezés eredménye • A gének meghatározott helyen találhatók • Bizonyított a genetikai átrendeződés (pl. inverzió, duplikáció stb.) • McClintock kimutatja kukoricában az áthelyeződő szabályozó elemeket • 30 évvel később a baktériumokban is felfedezik az áthelyeződő elemeket • Kis gyakoriságú jelenség (10-7-10-2/generáció) • Statikus genomkép átalakul a genom mozgásban van (genome in flux)

3. A genetikai elem mozgása DNS kicserélődéssel jár • Ez nem homológ szakaszok közt jön létre • RecA rendszertől független • Az áthelyeződés a transzpozíció • Az elem neve transzpozon

4. Transzpozon terminológia • A legtöbb baktérium transzpozon könnyen felismerhető géneket tartalmaz • Legtöbbször antibiotikum rezisztencia gént hordoz • A legtöbb rezisztencia gént hordozó transzpozon elnevezése Tn és egy szám (pl. Tn5) • Megegyezés szerint az elnevezés akkor is ez, ha nincs ismert tulajdonság • Ha hivatkozunk a hordozott génre azt az általános jelzéssel tesszük pl: Tn1(ampr)

5. Az elsőként felfedezett transzpozonok nem tartalmaztak ismert gént, ezért ezeket inzerciós szekvenciának nevezték el • IS elemek IS1, IS2 stb. • Van nénány nem standard módon elnevezett transzpozon (pl. Tn1000, amely az F plazmidon található,  néven is szerepel) • A transzpozonok gyakran valamilyen génen belül találhatók, mutációt okoznak • Az elnevezés, lacZ87::Tn3, a 87-es mutáció a lacZ génben, melyet a Tn3 beépülése okozott

6. Inzerciós szekvenciák • Az első áthelyeződő genetikai elemek E. coli-ból származnak (1967) • gal- és lac- mutáns kollekciót hoztak létre, melyek különleges tulajdonságokkal rendelkeztek

7. A mutációk jellegzetességei • 1. Nagymértékben poláris mutációk • az operon első génjébe térképeződött, de a hátrébb lévő gének terméke nem jelent meg • 2. A mutánsoknál nem volt reverzió • báziskicserélődéssel, frame-shift mutációval, azaz nem pontmutáció • Poláris mutációkról (korábban ismertek) kimutatták, hogy lánc terminációs mutánsok (revertálhatók) • 3. Ha egy poláris mutációt hordozó törzsbe plazmidot juttattak át, hasonló poláris mutációk jelentek meg a plazmidon hordozott génekben • 4. Fizikai kísérletek kimutatták, hogy a hasonló poláris mutációt hordozó plazmidok nagyobbak voltak, mint az eredeti • Azaz inzertált szekvenciákat hordoztak, erről feltételezték, hogy mobilis szakasz

8. Ha az előző poláris mutációt hordozó törzseket fággal fertőzték, olyan fágokat lehetett izolálni, melyek szintén poláris mutációt hordoztak • Fizikai vizsgálatok, heteroduplex analízis kimutatták, hogy a mutáció inzerció • Vad típusú és mutáns fág DNS-t denaturálták, majd hibridizálták • A vad és mutáns közötti különbség az inzerciós szekvencia, amely a hibridizálás során „kihurkolódott”) • Az inzerció nagysága ugyanaz, mint a heteroduplex analízisben a hurok nagysága • Ha különböző fág fajokkal fertőzték a poláris mutációt hordozó baktériumtörzset, akkor a mutáns fágok (más faj) hibridizáltak egymással, azaz az inzerciós szekvencia baktériumból származott

10. Többféle inzerciós elemet izoláltak, szekvenálás után a következő tulajdonságok derültek ki • A poláris mutációt okozó elemek transzkripciós stop szignált és mindhárom frame-ben transzlációs stop szignálokat hordoztak • Ezek okozzák a poláris hatást • Az IS elemek végein fordítottan ismétlődő (invereted repeat) szekvenciák találhatók pl. AGTC…..GACT, hosszuk 16-41 bp • Sok inzerciós helynél a beépülés iránya változó volt (nem csak egy irányban történt beépülés), target specifikusság • A különböző IS elemek különböző nagyságúak • Az elemek legalább két ORF-et (nyitott leolvasási keretet) tartalmaznak és a fehérjéket is kimutatták

11. Transzpozonok kimutatása baktériumokban • IS elemekkel ellentétben a transzpozonok hordoznak detektálható gént (pl. antibiotikum rezisztencia) • Ezekkel követni lehet az áthelyeződést • 1. R plazmid Ampr konjugációval RecA- recipiens törzsbe, melyben Kanr-t hordozó transzpozon van • Szaporítás során előfordul, hogy a Kanr transzpozon a plazmidra ugrik • A plazmidon két transzpozon is van Ampr és Kanr • Ezt érzékeny gazdába történő konjugációval mutatták ki

13. A beépülés általában véletlen szerű (random), nincs kitüntetett cél szekvencia • Vannak elkerült helyek • Preferált helyek (hot spot) • IS4 pl. 20 galT mutánsból mind egy helyen • Mu fág szinte bárhova inzertálódhat • A legtöbb transzpozon a kettő közötti specificitással rendelkezik

14. Transzpozíció kimutatása fággal • Lambda fág szaporítás • Gazda, recA-, Ampr R plazmid, az R plazmidon transzpozon okozza a rezisztenciát • Néhány fág részecske tartalmazza a transzpozont • Ezt a keverék lizátumot használták fertőzéshez Amps gazdán

15. Kis MOI és ampicillines szelekcióval a keletkező utód fág mind Ampr (a fágon lévő transzpozon rezisztenciát biztosít a gazdának, a vad típusú fágfertőzés során elpusztul a sejt és fág sem termelődik) • A tiszta Ampr fáglizátummal lizogén (homoimmunis) baktériumot fertőztek • A lizogén baktériumban nem szaporodik a fág, de a DNS bejut • Ampicillines szelekcióval olyan baktériumot izolálhatunk, amelyiknek a kromoszómájába beépült a transzpozon

17. Bakteriális transzpozonok típusai • IS elemek • 1. Kompozit transzpozonok • 2. Tn3 transzpozon család • 3. Áthelyeződő fágok

18. Kompozit (I-es típusú) transzpozonok • Két azonos / majdnem azonos IS elem határolja • Az IS elemek elhelyezkedése fordítottan ismétlődő vagy direkt ismétlődő (inverted, direct repeat) • A terminális szekvencia ugyanaz mindkettőnél • Az, hogy áthelyeződik vagy sem a transzpozon az IS elemtől (terminális) függ • Tn5, Tn9 és Tn10 • Elsőként úgy mutatták ki, mint olyan genetikai elemeket, amelyek plazmidról plazmidra ill. plazmidról fágra helyeződnek át • Elektronmikroszkóppal denaturálás és gyors renaturálás után stem loop (a fordítottan ismétlődő szakasz miatt)

21. Két érdekes tulajdonság • A terminális IS elemek önmaguk is áthelyeződhetnek • Sok kompozit transzpozonnál, ha kis méretű plazmidon van, akkor két különálló transzpozonként is viselkedhet • Ha egy plazmidon 2 IS elem van, akkor a plazmid minden része IS elem között van, azaz transzpozon

22. Transzpozíció mechanizmusai

24. Transzpozon családok

28. Tn3 transzpozon család • Minden Tn3-hoz hasonló elem két 38 bp nagyságú fordított szekvenciát tartalmaz • Nincsen IS-hez hasonló elem rajtuk • 3 gént hordoz, -laktamáz (ampicillin rezisztencia), két transzpozícióhoz szükséges gén (transzpozáz, reszolváz)

29. Áthelyeződő fágok • Két rokon fág Mu, D108 • A transzpozíció az életciklusuk része • A fág DNS replikációhoz transzpozíció szükséges

30. Transzpozíció (áthelyeződés) • Célszekvencia duplikálódás a beépülés helyén • A transzpozonok és transzpozon célszekvencia kapcsolat szerkezete • Replikatív transzpozíció • A Tn3 transzpozíciója során a kointegrátum az intermedier • A replikatív transzpozíció mechanizmusa • Nem replikatív transzpozíció

31. A transzpozíció eredménye, hogy a transzpozon a recipiensbe épül • A transzpozon és inzerciós hely között nincsen homológia • recA rendszer sem szükséges hozzá

32. Célszekvencia duplikálódás a beépülés helyén • A beépüléskor a cél szekvencia duplikálódik • A transzpozon a két szekvencia között van • A célszekvencia hossza transzpozontól függ, de egyfajta transzpozonnál mindig ugyanaz • A cél szekvencia transzpozíciónként más és más, de a hossza ugyanaz

34. A transzpozáz vágja a DNS-t • „lépcsős” hasítás, vagy két egyszálú nick • A transzpozon a szabad véghez kapcsolódik • Az egyszálú részek feltöltödnek • Ez okozza a cél duplázódását • A duplikáció nem feltétele a transzpozíciónak

36. A transzpozonok és transzpozon célszekvencia kapcsolat szerkezete • A transzpozonok jól meghatározott végekkel rendelkeznek • Minden inzerciónál a transzpozon végei ugyanazok • Minden transzpozon saját vég szekvenciával rendelkezik • Beépüléskor a transzpozon végek a nick-ekhez kapcsolódnak

37. A legtöbb transzpozonnál a két vég ugyanaz a szekvencia csak fordított orientációban • Néhány kivétel • A transzpozonok végei esszenciálisak a transzpozícióhoz • Báziscsere, inzerció, deléció a terminális szekvenciában megakadályozza a transzpozíciót

39. Replikatív transzpozíció • A gazda szaporítása a során (10-7 gyakoriság) a transzpozon a plazmidról átkerülhet egy másik plazmidra • Egyes transzpozonoknál ilyenkor mindkét plazmidon megtalálható a transzpozon • Az eredeti és egy replikálódott változat • Ugyanilyen kis gyakorisággal plazmid kointegrátum keletkezik • A két plazmid direkt ismétlődik és két transzpozon van a csatlakozási helynél • A nem replikatív transzpozonoknál nincs kointegrátum

41. A Tn3 transzpozíciója során a kointegrátum az intermedier • A Tn3 (és a hasonló transzpozonok) replikatív módon helyeződik át • A keletkező kointegrátum intermedier a transzpozíció során

42. A Tn3 szerkezete • Két terminális fordított ismétlődő szakasz határolja • 3 gén • tnpA, transzpozáz, a kointegrátum kialakításáért felelős • tnpR, reszolváz, represszálja a TnpA szintézisét, helyspecifikus DNS szál kicserélődést katalizál, azaz a kointegrátumot megoldja • res hely, belső megoldó hely • -laktamáz, ampicillin bontás

43. Tn3 szerkezete

44. Mutációk a génekben • tnpA, nem képes áthelyeződni, kointegrátumot képezni • tnpR, res mutánsok képesek kointegrátumot létrehozni, de nincsen áthelyeződés (tnpR mutáns recA+ törzsben megoldódik) • Áthelyeződés két lépésből áll • tnpA kointegrátumot hoz létre • tnpR katalizálja a res helyen keresztüli kicserélődést • Néhány nem Tn3 családba tartozó transzpozonnál nincs reszolváz • A kointegrátum homológ rekombinációval is megoldódhat, mert két homológ (transzpozon) szakasz is van a DNS molekulán, nem recA, hanem transzpozon kódolt rekombináz

46. A replikatív transzpozíció mechanizmusa • 1. A transzpozon egy kópiája megmarad a donor DNS-en az eredeti helyén • 2. Az intermedier egy kointegrátum • 3. Rövid DNS darab ismétlődik a transzpozon széleinél (target duplikáció) • 4. Néhány transzpozonnál szükséges egy belső megoldó hely, vagy homológ szakaszok közti kicserélődés

47. A replikatív transzpozíció indításához két lépés kell • A két egyszálú szakasz összekapcsolódik (anélkül, hogy bázis párosodás lenne) ez a csatlakozási pont • Replikációs villa keletkezik a ligálás után

48. A replikatív transzpozíció lépései • A transzpozáz egy szálat elvág a cél szekvenciában, majd a másik szálat egy kicsit odébb, az eredmény ragadós vég • A transzpozon ellentétes végén a komplementer szálon hasítás. Mindkét 3’ vég a recipiens 5’ túlnyúló végéhez kapcsolódik, ez két replikációs villát eredményez • A replikáció a cél szekvencia 5’ végénél kezdődik (a ragadós vég szintézisével). Amikor a replikáció befejeződik kointegrátum keletkezik, két transzpozon kópiával • Kétszálú kicserélődés történik a transzpozon két kópiája között. Vagy a belső megoldó hely vagy a homológ szakaszok között

50. Nem replikatív transzpozíció • Konzervatív cut&paste • DNS szintézis csak a transzpozon és target közötti rések feltöltéséhez szükséges • Kísérletes bizonyíték • lacZ mutáns Tn10-en • Heteroduplex, az egyik szál mutáns a másik vad típus • Replikációkor vagy egyik vagy másik szál • Nem replikatív átvitelnél mindkét szál öröklődik