Orario lezioni

1. Orario lezioni Canale B: 24/4 11:00-13:00 29/4 11:00-13:00 30/4 8:30-10:30 2/5 8:30-10:30 6/5 11:00-13:00 8/5 11:00-13:00 15/5 11:00-13:00 16/5 11:00-13:00 Canale A: 23/4 11:00-13:00 28/4 11:00-13:00 2/5 11:00-13:00 5/5 11:00-13:00 7/5 14:00-16:00 12/5 11:00-13:00 14/5 11:00-13:00 19/5 11:00-13:00

2. Identificazione dei geni responsabili di patologie ereditarie

3. Perchè è importante identificare i geni associati a patologie umane? • Conoscere il gene vuol dire avere uno strumento per la diagnosi molecolare della malattia. Importante soprattutto per la diagnostica prenatale e per la consulenza genetica. • La conoscenza del gene è fondamentale per capire i meccanismi molecolari della malattia e per elaborare modelli sperimentali che consentano di studiarla più facilmente. • La conoscenza dei geni-malattia è importante per elaborare strategie terapeutiche mirate, sia di tipo tradizionale, sia di terapia genica.

4. Come si possono identificare i geni responsabili di patologie nell’uomo? • Clonaggio funzionale • Clonaggio posizionale • Approccio del gene candidato indipendente dalla posizione genomica • Approccio del candidato posizionale

5. Approcci di clonaggio funzionale • Identificazione e purificazione della proteina responsabile. Sequenziamento di peptidi. Identificazione del gene basata sulla sequenza dei peptidi. • Clonaggio per complementazione

6. Clonaggio del gene a seguito di isolamento della proteina: Identificazione del gene dell’emofilia A (fattore VIII)

7. Purificazione con tecniche biochimiche tradizionali

8. Microsequenza AGGFLMKMFGGHTSREDFCH AHHTFIAAVEQLWDYGMATT FGKRMLKFSSCHTRDEGGAK

9. Sequenze possibili N A C G GCU GCA A C G GCU GCG A C G GUU GUC A C C G UUU CUG A C G GGU GGU C A C AUU AUC C CAU CAC C UAU UAU C UUU UUC A GAG GAA A CAG CAG C GAU GAU C UAU UAC UGG UGG AUG AUG His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met mRNA 5’ 3’ Sequenza effettiva

10. A C G GCU A C G GCU A C G GUU A C C G UUU A C G GGU 5’ 3’ A C AUU C CAU C UAU C UUU A GAG A CAG C GAU C UAU UGG AUG His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGATTACGGTATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG Ibridazione di cDNA library con oligonucleotidi degenerati --------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG----------- --------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC-------------

11. Ibridazione di cDNA library con oligonucleotidi degenerati TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGATTACGGTATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG --------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG----------- --------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC-------------

12. Ibridazione di cDNA library con oligonucleotidi degenerati TGGGATTATGGTATG TGGGACTATGGTATG TGGGATTATGGGATG TGGGACTATGGGATG TGGGATTATGGCATG TGGGACTATGGCATG TGGGATTATGGAATG TGGGACTATGGAATG TGGGACTACGGTATG TGGGATTACGGGATG TGGGACTACGGGATG TGGGATTACGGCATG TGGGACTACGGCATG TGGGATTACGGAATG TGGGACTACGGAATG --------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG----------- TGGGATTACGGTATG --------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC-------------

13. PCR con oligonucleotidi degenerati N A C G GCU GCA A C G GCU GCG A C G GUU GUC A C C G UUU CUG A C G GGU GGU C A C AUU AUC C CAU CAC C UAU UAU C UUU UUC A GAG GAA A CAG CAG C GAU GAU C UAU UAC UGG UGG AUG AUG His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Gln Leu Trp Asp Tyr Gly Met 5’ 3’ A C C C C 5’CATTATTTTATTGC 3’ 5’--------CACTATTTCATCGCAGCGGTCGAACAGCTGTGGGATTACGGTATG-----------3’ 3’--------GTGATAAAGTAGCGTCGCCAGCTTGTCGACACCCTAATGCCATAC-----------5’-- 3’ACCCTAATACCATAC 5’ G G C G T

14. PCR con oligonucleotidi degenerati atgttgaagttcaagtatggtgtgcggaacccgccggaggccagtgcctccgagcccatt M L K F K Y G V R N P P E A S A S E P I gccagtcgggcctccaggctaaatctcttcttccaggggaaaccgcccctcatgactcaa A S R A S R L N L F F Q G K P P L M T Q cagcagatgtctgctctttcccgggaagggatgctagacgccctcttcgctctctttgaa Q Q M S A L S R E G M L D A L F A L F E gagtgcagccaacccgccctgatgaagatgaagcacgtgagcagctttgtccagaagtat E C S Q P A L M K M K H V S S F V Q K Y tccgacaccatagccgagttgcgggagctgcagccgtcggcgagagacttcgaagttcga S D T I A E L R E L Q P S A R D F E V R agccttgtgggctgtggtcacttcgctgaagtgcaggtggttagagagaaggcgaccggg S L V G C G H F A E V Q V V R E K A T G gacgtctatgccatgaaaatcatgaagaagaaggctttgctggcccaggaacaggtttca D V Y A M K I M K K K A L L A Q E Q V S tttttcgaggaggagaggaacatattatctcggagcacgagtccttggatcccccagtta F F E E E R N I L S R S T S P W I P Q L

15. Esempio di clonaggio per complementazione: Anemia di Fanconi • Sindrome autosomica recessiva • Anemia prograssiva, pancitopenia • Difetto di riparazione del DNA • Anomala sensibilità alle radiazioni ionizzanti e ai chemioterapici

16. Radiazioni ionizzanti Linea cellulare da paziente Linea cellulare normale Cellule morte Cellule vive Saggio funzionale

17. Screening funzionale Vettore plasmidico cDNA normale Linea cellulare da paziente cDNA library da soggetto normale Radiazioni Cellule trasfettate con library Clone Analisi del plasmide

18. Altro esempio di clonaggio funzionale: identificazione di oncogeni cellulari Cellule tumorali cDNA library in vettore di espressione Cellule normali Cellula trasformata Le cellule trasformate sono in grado di crescere in particolari condizioni, come terreni di coltura senza siero, e formano colonie isolabili Purificando e sequenziando il DNA plasmidico presente nelle colonie trasformate si possono identificare gli oncogeni