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Dra. María Cecilia Villa

Prueba de sensibilidad a antibióticos. Difusión en agar ( Kirby -Bauer). Dilución en caldo. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y de la concentración bactericida mínima (CBM). Dra. María Cecilia Villa. San Luis, 8 de abril de 2014. Temas a desarrollar

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  1. Prueba de sensibilidad a antibióticos. Difusión en agar (Kirby-Bauer). Dilución en caldo. Determinación de la concentración inhibitoria mínima (CIM) y de la concentración bactericida mínima (CBM). Dra. María Cecilia Villa San Luis, 8 de abril de 2014

  2. Temas a desarrollar • Introducción teórica Definición Clasificación Mecanismos de acción Mecanismos de resistencia Nuevos antimicrobianos Descripción teórica de Métodos de Antibiogramas (Difusión en agar, Dilución en caldo, Microdilución en caldo, E-test) • Explicación práctica Difusión en agar Dilución en caldo

  3. Introducción teórica del tema…

  4. ANTIMICROBIANOS (ATM) Sustancias capaces de inhibir el crecimiento e incluso destruir determinadas especies microbianas de forma específica, a bajas concentraciones y sin toxicidad, o muy baja, para el organismo humano. Estos compuestos pueden estar producidos por microorganismos vivos (antibióticos) o por síntesis química (quimioterápicos). Fig. 1.- Fleming y la penicilina. En 1928, realizaba varios experimentos en su laboratorio, y el dia 22 cuando observaba sus cultivos antes de descartarlos, notó que la colonia de un hongo había crecido espontáneamente, como contaminante en una de las Placas de Petri sembradas con Staphylococcus aureus . Fleming observó mas tarde las placas y comprobó que las colonias bacterianas que se encontraban alrededor del hongo (mas tarde identificado como Penicillium notatum) eran transparentes debido a una lisis bacteriana. Penicillium produce penicilina, la cual posee efectos antibacterianos.

  5. Características de un antimicrobiano 1.- Especificidad Se refiere al espectro de la actividad antimicrobiana, definida por su capacidad de unión a un sitio específico de la bacteria. 2.- Eficacia “in vivo” Debe ser bacteriostático o bactericida in vivo, es decir, su acción no debe ser revertida en el interior del organismo. 3.- Toxicidad selectiva Debe ser tóxico para el microorganismo, pero ser inocuo para el huésped. Esto es indispensable para la utilización del antimicrobiano en clínica.

  6. Por su origen • Por su espectro de acción • Por la forma de acción • Por su estructura • Por su mecanismo de acción CLASIFICACIÓN

  7. Por su origen Biológicosproducidos por microorganismos • Hongos filamentosos (especialmente Penicillium) que producen antibióticos como la penicilina y la griseofulvina. • Bacterias (del género Bacillus) de las que se obtienen antibióticos como la bacitracina y la polimixina. • Actinomycetos (del género Streptomyces) que producen antibióticos como la estreptomicina, cloranfenicol, tetraciclina y eritromicina. • Semisintéticosptan un núcleo básico biológico con radicales obtenidos por síntesis como cefalosporinas • Sintéticos obtenidos por síntesis química como nitrofuranos, sulfamidas

  8. Por su espectro de acción Amplio espectro; G+ y G- cloranfenicol tetraciclinas penicilinas de amplio espectro Espectro intermedio; G+ penicilinas macrólidos Corto espectro;Cocos G+ y bacilos G- polimixinas

  9. Por la forma de acción Bacteriostáticos Bactericidas Bacteriolíticos sint. de proteínas met. intermedios sint. de proteínas sint. ácidos nucleicos sint. pared celular integridad de la membrana

  10. Por su estructura •  - lactámicos: penicilina y cefalosporinas • Tetraciclinas • Polipéptidos • (ej. valinomicina) • Aminoglicósidos • (ej. amikacina) • Macrólidos • Cloranfenicol

  11. Por su mecanismo de acción

  12. Resistencia a los antimicrobianos • Una cepa bacteriana es resistente a un ATM determinado cuando para inhibirse necesita concentraciones de fármacos superiores a la concentración que el agente ATM puede alcanzar en el sitio de la infección. • Incremento de la CIM • Tipos de resistencia • El microorganismo puede carecer de la estructura sobre la que actúa el Ab, puede inactivarlo, puede ser impermeable, puede modificar la diana del Ab, puede bloquearlo por medio de una via metabólica alterada, puede bombearlo hacia afuera. • Resistencia natural Resistencia adquirida

  13. RESISTENCIA ADQUIRIDA • Capacidad adquirida de un microorganismo para resistir los efectos de un antimicrobiano al que es habitualmente sensible. • Bases genéticas • La resistencia adquirida a un antimicrobiano se debe a cambios en la carga genética de la bacteria. • Cromosómica. Alteración estructural del DNA cromosómico MUTACIÓN • Plasmídica. Adquisición de DNA extracromosómico • Plásmidos de resistencia conjugativosR • Resistencia a varias drogas a la vez • Conjugación • Plásmidos de resistencia no conjugativosr • Falta de transferibilidad conjugativa . • Transformación / Transducción • Espectro de resistencia menor (rara vez resistencia múltiple). • Son de tamaño menor a R.

  14. Resistencia a antimicrobianos: Mecanismos bioquímicos Inactivación enzimática del antibiótico.Ej. Penicilina Disminución de la permeabilidad hacia el antibiótico . Ej.Tetraciclina Eliminación de antibiótico mediante Bomba de Eflujo. Desarrollo de vias metabólicas alternativas. Síntesis de una enzima resistente. Capacidad para usar ácido fólico preformado no requieren PABA (ác. paraminobenzoico). El cual desplaza sulfonamida desde dihidropteroato sintetasa. Ej. Sulfonamidas Modificación química de la diana sobre la que actúa el antibiótico. Alteración de la proteínas P10 ribosomal. Ej. Estreptomicina Peleg, A. Y. et al (2010) Hospital-acquired infections due to gram-negative bacteria. The New England Journal of Medicine, Volume 362:1804-1813, May 13 2010

  15. El antibiótico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes eliminando las sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presión de selección. • El aumento de la frecuencia de las cepas resistentes va unido casi siempre al uso intensivo del antibiótico en cuestión. • Prescripción formal o libre de medicamentos para uso terapéutico en humanos o animales. • Utilización generalizada de antimicrobianos en pacientes inmunocomprometidos y en la unidad de cuidados intensivos. • Uso de dosis o duración inadecuada de la terapia antimicrobiana. • Desconocimiento de los perfiles de sensibilidad a los diferentes microorganismos.

  16. Nuevos antimicrobianos • Nuevos análogos de los antimicrobianos existentes • Realizando sustituciones químicas que le otorga ventajas como mayor solubilidad, afinidad o menor reconocimiento por los factores de resistencia • Productos naturales. Péptidos antimicrobianos ( de plantas y animales), por ej.: • Magainina, péptido catiónico que actúa como agente protector. Se encuentra en la piel de ciertas ranas. Forma canales en la membrana citoplasmática. • Platensimicina , descubierto recientemente de Streptomyces platensis, inhibe la síntesis de lípidos en bacterias. Fármaco especialmente activo contra bacterias gram-positivas multiresistentes. • Diseño de medicamentos por ordenador. Saquinavir, inhibidor de proteasa, HIV • Genes antisense DNA complementario que se une a genes de virulencia del patógeno y previenen la transcripción Ej: fornivirsen

  17. Debido a la resistencia a antibióticos, debe determinarse la sensibilidad a antibióticos de las bacterias aisladas de muestras clínicas. • Antibiogramas • Técnica que permite demostrar la sensibilidad o resistencia de un microorganismo a la acción de distintos antimicrobianos. • Los principales métodos para aerobios y anaerobios facultativos son: • Difusión en agar (Kirby-Bauer) • Dilución en caldo • Técnica del Epsilómetro (E-test)

  18. Método de difusión en agar (Kirby-Bauer) El principio del método involucra el uso de una cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel) aplicados sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el microorganismo en cuestión. • Es el recomendado por CLSI (Clinical and Laboratory Standars Institute)(Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing) y es el método descrito de manera más completa para el cual se han desarrollado tablas de interpretación que están respaldadas por datos clínicos y de laboratorio. • Es más accesible y de uso común en los laboratorios de diagnóstico clínico. • Ha sido estandarizado para patógenos de rápido desarrollo:Staphylococcusspp., • Pseudomonas aeruginosa, Enterococcusspp., Enterobacteriaceae • Y ha sido modificado para probar algunos microorganismos nutricionalmente exigentes como Haemophilusspp., Neisseriagonorrhoeae, Streptococcuspneumoniae, estreptococos β hemolíticos y del grupo víridans y Micobacterias.

  19. Estandarización del método • Para que los resultados sean confiables los procedimientos deberán ser controlados y estandarizados. • El medio de cultivo: AgarMüellerHinton(4 mm de alto; pH 7,2 - 7,4 ). • Presenta buena reproducibilidad de resultados de lote a lote. • Es pobre en contenido de timina o timidina (compiten con sulfonamidas, trimetroprimas y tetraciclinas), lo que daría falsas resistencias. • Es adecuado para el desarrollo de la mayoría de las bacterias patógenas. • Existen suficientes datos que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio. • El inóculo: cultivo joven, densidad de microorganismos (1x108 UFC/ml), preparación reciente. • La colocación de los discos: tiempo de colocación luego de la siembra (3 – 5 min), distancia entre discos (22 mm) y número por placa (3 -5). • Temperatura y tiempo de incubación: 35 a 37ºC durante 18 a 24 horas.

  20. Elección del antimicrobiano • Existen tablas sugeridas por CLSI, con las recomendaciones de los antimicrobianos a estudiar para cada grupo bacteriano, que se basan en factores microbiológicos, clínicos y farmacológicos. • Todos los antibióticos deberán usarse por su nombre genérico. • En general, deberá incluirse sólo un representante de cada grupo de drogas relacionadas con actividad casi idéntica y para las cuales la interpretación podría ser la misma. • Rara vez se realizan pruebas de sensibilidad para microorganismos sensibles a una droga altamente eficaz, por ejemplo Streptococcuspyogenes y Neisseriameningitidisque han mantenido invariable su sensibilidad a la penicilina.

  21. Método de dilución en caldo Para cuantificar la actividad antimicrobiana se puede medir la sensibilidad de un cultivo por la técnica de dilución en caldo. Es uno de los primeros que se llevó a cabo y aún hoy sirve como método de referencia porque permite la determinación cuantitativa de la sensibilidad al antibiótico, pero es laborioso y costoso, por lo tanto se limita su uso a casos especiales. En el método de dilución en caldo se colocan concentraciones decrecientes del agente antimicrobiano, generalmente diluciones al medio (1:2) en tubos con un caldo de cultivo que sostendrá el desarrollo de los microorganismos. El caldo más comúnmente usado es el de Mueller-Hinton. Además se realizan un C + y C -. Inóculo estándar del microorganismo: 1 x 106 organismos/ml. Se incuba de 18-24 h a 35°C y se observa la turbidez de los tubos que indicará desarrollo bacteriano. El microorganismo crecerá en el tubo control positivo y en todos los otros que no contengan suficiente antimicrobiano. Se determina la CIM Y CBM.

  22. CIM Concentración inhibitoria mínima (CIM) Corresponde a la menor concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano luego de 18 a 24 horas de incubación. CIM Concentración bactericida mínima (CBM) Corresponde a la menor concentración de antimicrobiano capaz de matar un 99,9% de la población bacteriana. CBM

  23. Método de microdilución en caldo Es una adaptación de la prueba de dilución en caldo a policubetas para microdilución. Estas microplacas de 96 pocillos se pueden adquirir en el comercio y tienen la ventaja de haber sido preparadas bajo estándares de control de calidad muy estrictos que aseguran resultados consistentes. Empleo de autoanalizador (mediciones por turbidez o fluorescencia) o, simple lectura óptica. Otra ventaja es que se pueden estudiar varias cepas al mismo tiempo y con varios antimicrobianos

  24. Método del Epsilómetro (E-Test) • Consiste en una tira plástica estéril no porosa de 6 cm de largo por 5 mm de ancho que incorpora de un lado un gradiente predefinido de antimicrobiano equivalente a 15 diluciones, y del otro lado presenta una escala de lectura e interpretación. • La inoculación y el cultivo se realiza igual que en la técnica de Kirby-Bauer. • Para leer el resultado se valora la zona de inhibición, de forma elíptica, alrededor de cada tira. La CIM se lee directamente observando el punto más bajo de la elipse que presente crecimiento. • Características • Permite estudiar una cepa individual frente a diferentes agentes. • Una de sus grandes ventajas, dadas sus características, es que resulta un método ideal para estudiar cualquier tipo de microorganismo, aerobio o anaerobio, incluyendo aquellos llamados "fastidiosos" o los que tengan requerimientos especiales para crecer.

  25. En la fotografía inferior de la izquierda se muestra una vista general de una placa con crecimiento bacteriano y con dos tiras de E-test. Las elipses más oscuras que rodean la parte superior de las tiras E-test marcan las zonas en que los respectivos antibióticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el crecimiento del microorganismo en estudio. En la foto inferior de la derecha se aprecia como el pico de la zona más estrecha de la elipse en la tira de MZ coincide, en la escala graduada, con la franja entre las marcas de 1.5 y 2, lo que nos indicaría que la CIM de este antibiótico (MZ) para este microorganismo sería de 2 µg/ml.

  26. En el Trabajo Práctico de Laboratorio…

  27. MATERIALES • Mecheros • Ansa en anillo • Tubos con solución fisiológica estéril • Placas estériles • Hisopos estériles • Medio de cultivo agar Müeller Hinton • Pinzas metálicas • Reglas • Discos con antimicrobianos • Microorganismos de ensayo • Patrón de turbidez (escala de Mc Farland) Explicación método de difusión en agar (Kirby-Bauer) Día 1 Preparación de las placas con el medio de cultivo Se vierten 25 a 30 ml de agarMüellerHintonfundido en placas estériles de 100 mm de diámetro, para obtener una altura de 4 mm. Para eliminar la humedad se colocan las placas de 15 a 30 min. en estufa de cultivo a 37ºC. Preparación del inóculo Se toman 4 o 5 colonias bien aisladas y de igual morfología de la placa de cultivo de 18 a 24 horas de incubación, con un ansa y se introducen en 5 ml de caldo tripteína soja. Si la turbidez obtenida es la adecuada, no es necesario una incubación posterior, caso contrario, se incuba a 37ºC hasta lograr la turbidez del testigo, la que termina de ajustarse agregando solución fisiológica si es necesario. El testigo a usar corresponde al 0,5 de la escala de Mc Farland.

  28. Siembra de las placas Se sumerge un hisopo de algodón estéril en el inóculo, oprimiendo el algodón contra las paredes internas del tubo para descartar el exceso de líquido. Se aplica el hisopo sobre la superficie de las placas estriando uniformemente y rotando la placa cada 60º. Colocación de los discos Esperar entre 3 a 5 minutos y no más de 15 minutos antes de aplicar los discos, para que el exceso de humedad superficial sea absorbido. Colocar los discos con una pinza estéril cuidando que tengan un buen contacto con la superficie del agar haciendo una ligera presión. (22mm y 15 mm) Incubación de las placas Incubar las placas invertidas, en grupos no superiores a 5 placas, a 35ºC en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos durante 18 a 24 horas.

  29. Día 2 Medición de las zonas de inhibición Con una regla o calibre, se mide el diámetro de los halos incluyendo el disco de 6 mm. • Diámetro • la cantidad de antimicrobiano añadido al disco • la solubilidad del agente • el coeficiente de difusión • la eficacia del ATM

  30. Resultados Estándares de interpretación de zonas de diámetro. Existen tablas específicas CLSI periodicamente publicadas que indican los criterios para interpretar los diámetros de zonas para categorizar exactamente los niveles de susceptibilidad de los microorganismos a diferentes agentes antimicrobianos. Categorías Interpretativas. Sensible Una infección debido a una cepa puede ser apropiadamente tratada con la dosis de agente antimicrobiano recomendado para ese tipo de infección y especie infectante. Intermedio Implica eficacia clínica en sitios del cuerpo donde la droga es fisiológicamente concentrada (por ej. quinolonas y ß-lactámicos en orina) o cuando una dosis mayor que lo normal de una droga puede ser usada (por ej. ß-lactámicos). Resistente Las cepas resistentes no son inhibidas por la concentración sistémica usualmente alcanzable de un agente cuando los esquemas de dosificación normal son usados.

  31. Resultados erróneos

  32. Explicación método de dilución en caldo (tubo) • MATERIALES • Tubos con el microorganismo desarrollado • Tubos para estandarizar el inóculo • Tubos con 1 ml de concentraciones decrecientes del antibiótico en caldo Müeller-Hinton • Tubos con 1 ml de caldo Müeller-Hinton • Placas con agar para recuento Estandarizar el inóculo: Se obtiene realizando diluciones de una suspensión bacteriana comparando con el tubo número 1 de la escala de Mc Farland (1 x 106 UFC/ml), preparar 10 ml. Día 1 Colocar 1 ml del inóculo a cada uno de los tubos que contienen 1ml de caldo con el antibiótico en las concentraciones indicadas (µg/ml) y al control sin antimicrobiano (C +), dejar un tubo sin inocular (C -). Los agentes antimicrobianos se preparan en soluciones concentradas y luego se diluyen en caldo. Los tubos contienen ahora 2ml con 5 x 105 UFC/ml y el antibiótico en las concentraciones indicadas (µg/ml) Tomar 100 µl del control negativo e inocularlo en agar Incubar 24 h a 37°C.

  33. Se observa turbidez a simple vista. 0,1 ml de los caldos no turbios se subcultiva en agar. Día 2 CIM: Menor concentración de antimicrobiano que inhibe el crecimiento bacteriano. Se determinan las UFC en el tubo control por recuento de colonias (500 UFC= 5 x 105/ml inóculo original) Dado que incluso las drogas bactericidas no siempre esterilizan totalmente una población bacteriana, para medir la capacidad de un antimicrobiano de matar a un microorganismo se debe realizar la prueba de actividad bactericida. Se determinan las UFC en los subcultivos de los caldos no turbios. 7 UFC = 70 UFC/ml en el tubo que contiene 8 µg/ml de antibiótico. 7 UFC/ml < 0,1% de 5 x 105/ml que contenía el inóculo original. Día 3 CBM: Menor concentración de antimicrobiano capaz de matar un 99,9% de la población bacteriana.

  34. Bibliografía…

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