AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE YENİLİKLER

1. Yrd.Doç.Dr.Hakan Özveri Acıbadem Üniversitesi Tıp Fakültesi Üroloji Anabilim Dalı AZOSPERMİK İNFERTİL ERKEKTE GENETİK TESTLERDE YENİLİKLER

2. Genetikte Yaşanan Gelişmeler • “ERA of GENOMICS” • “GENETİK ÇAĞI” • Tüm DNA sekanslarının sistematik olarak çalışılarak ortaya konulması • Human Genome Project(HGP)- İnsan Genom Projesi • International Hapmap Project • Encylopedia of DNA Elements Project(ENCODE)

3. Genetikte Yaşanan Gelişmeler • 30-35 bin gen (Tahmin 80-140 bindi) • Normal spermatogenezde görev alan gen sayısı: 2000 ve üzeri • 1 no’lu kromozom- 2968 gen • Y Kromozumu- 231 gen • Gen az ama ürün çeşitliliği inanılmaz!!!(500 bin-1 milyon protein)

4. Microarray Teknolojisi • Gen çipi • DNA çipi • Biyoçip • Ekprese edilen binlerce genin ekspresyon düzeyini aynı anda izlemek için sıralı bir şekilde oluşturulmuş DNA spotları

5. Microarray Teknolojisi • Microarray’de onbinlerce spot • Yüzeye tutturulan DNA segmentleri (20 ile 100 ya da daha fazla nükleotid uzunluğunda olabilir) probe olarak tanımlı

6. Microarray Teknolojisi • Tüm sekanslama girişimlerinde olduğu gibi microarray kullanımında da amaç • Bir organizmanın belirli bir hücresinde,belirli bir zamanda ve belirli koşullar altında hangi genler ifade edilmektedir?

7. Microarray Teknolojisi Anormal Hücreler Normal Hücreler RNA İzolasyonu Reverse Transcriptase İşaretleme Microarrayde Hibridizasyon

8. Microarray Teknolojisi-İnfertilite • Spermiyogramda anomali saptanmayan fertil ve infertil erkeklerde Microarray analizlerinin karşılaştırılması • Fertil ve infertil erkeklerin Transkriptom’ları arasında istatistiki fark var. Özellikle erkek gamet formasyonu ve maturasyonu ile ilgili genlerin ekspresyonlarında anlamlı farklar mevcut. Garrido N ve ark., Fertil Steril; Vol 91, No: 4, Supp Nisan 2009

9. Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji Tanı (n=500) % Varikosel 34.0 Obstrüksiyon 26.0 Testiküler Yetmezlik 16.4 Idiyopatik 26.0 Ejakülatuar 2.4 Kriptorşidi 3.0 ASA 2.0 Genetik nedenler 0.5 Gonadotoxinler 2.0 Infeksiyonlar 1.0 Sistemik hastalıklar 0.2 Endokrinopati 1.0 Travma 1.0 Çoğunluğunda tam gösterilememiş olsa daGENETİK PATOLOJİ? HGP Öncesi

10. Erkek Faktörüne Bağlı İnfertilitede Etyoloji 1. Genetik (%15-20) A)Kromozomal Bozukluklar Azoospermi- Normospermi ~%5.8 Klinefelter Sendromu (XXY) Azoospermi-Şiddetli Oligospermi ~%4.15 Diğer Eşey kromozomal değişik. Azoospermi- Normospermi %0.15 Robertsonian Translokasyonlar Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %0.75 Resiprokal Translokasyonlar Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi %0.75 B)Y Kromozom Delesyonları Azoosopermi-Şiddetli Oligospermi ~%8.2 AZFa Azoospermi-SCOS %0.4 AZFb Azoospermi-Spermatogenik Arrest %1.3 AZFc Azoospermi-Şiddetli Oligospermi %2.7 AZFb-c SCOS/Spermatogenik Arrest %0.7 AZFa-b Azoospermi-SCOS-Şid. Oligospermi %0.1 AZFa+b+c Azoospermi-SCOS %0.3 Parsiyel AZFc Azoospermi-Normospermi %2.3 AZF dışında %0.5 C)Gen Mutasyonları %1-6 CFTR (CBAVD hastalarında %60-70) Obstrüktif Azoospermi %5 AR Azoospermi-Oligospermi %1.7 INSL3-LGR8 Kriptorşidizm <%5 2.Varikosel (%35) 3. İdiyopatik (%25) 4. Enfeksiyon (%10) 5. Endokrin (<%5) 6. İmmünolojik (<%5) 7. Kanal Obstrüksiyonları(<%5)

11. İNFERTİLİTEDE GENETİK 9.766 İnfertil Erkek94.465 Erkek Yenidoğan Kromozomal Anomali %5.8 %0.38 Seks Kromozomal Anomali %4.2 %0.14 Otozomal Kromozomal Anomali %1.5 %0.25 Johnson MD, Fertil Steril,1998;70:397 Van Assche E, Hum Reprod, 1996;Dec; 11 Suppl 4:1-24.

12. İnfertilite - Azoospermi: % 5-20 %

13. Azoospermi değerlendirmesinde Amaç – Ürolog gözüyle • Düzeltilebilir patolojilerin saptanması ve tedavisi • İnfertilite ile görülebilen hayatı tehdit edici hastalıklarıntanınması ve tedavisi • Üremeye yardımcı tedavi yöntemlerine gereksinimi azaltmak- maliyetin düşürülmesi • Üremeyeyardımcı tedavi yöntemleriile çocuklara geçebilecek genetik geçişli patolojilerin saptanması ve çiftlerin bilgilendirilmesi

14. Azoospermi Değerlendirmesi Anamnez Fizik muayene Semen analizi (2x) Hormonal değerlendirme Genetik değerlendirme TEDAVİ Radyolojik değerlendirme Biyopsi/Sitoloji • Azoospermi • En az 2 semen analizinde, mikroskopik incelemede ejakülatta hiç spermatozoa görülmemesi durumu 10 20

15. GENETİK BOZUKLUKLAR • Grup I:Kromozoma ait nümerik ya da yapısal anomaliler • 47 XXY • Kromozomların yapısal anomalileri • (delesyon, duplikasyon, inversiyon, translokasyon) • Grup II:Epigenetik • Mutasyon ya da kırılma olmaksızın oluşan ve gen ekspresyonunu değiştiren biyokimyasal DNA modifikasyonları(DNA Metilasyonu, Histon Metilasyonu, Histon asetilasyonu, histon fosforilazyonu, kromatin re-modelling) • Grup III:Tek gen hastalıkları • Kistik Fibrozis • Grup IV:Poligenik/multifaktöryel genetik hastalıklar • En sık görülen ve insanda infertilitede dahil hastalıkların çoğunluğunda etyolojikfaktör • Grup V: Non-Kromozomal DNA Mutasyonları • Mitokondriyal Mutasyonlar

16. Kromozomal Anomaliler(Nümerik) • Klinefelter Sendromu (47 XXY – Non-mozaik Form) • 1/500-1/1000 canlı doğumda • Azospermide en sık kromozomal neden(%14) • Atrofik testisler ( ~ 5 ml) • Azospermi • Jinekomasti • KS’lu hastaların %80-100’ünde normal haploid sex kromozomu • Sperm elde etme oranları %27-45 • Denschlag ve ark., Fertil Steril, 2004 Klasik Triad ?

17. Klinefelter Sendromu • Tanı • Periferik kandan karyotip analizi • Uzun süre, fazla işgücü, pahalı, Mozaik tipte düşük sensitivite • 2.Yanak içi mukozasından Barr Body(Cisimcik) SitolojisiUcuz ve sensitif • 3.FISH • Pahalı, tecrübeli eleman, software • 4.X Kromozomu üzerindeki iki genin metilasyon düzeyleri arasındaki fark – 5 $ • Familial Mental Retardation Gene 1 (FMR1) ile • X-Chromosome Inactivating Transcript(XCIT) • Quantitative Flourescence PCR- • Multipl genetik patoloji

18. Kantitatif Floresan PCR(QF-PCR) • Seks kromozom anomalileri • Mikrodelesyonlar/Duplikasyonlar • AR CAG tekrarları • Bütün kromozomal bozuklukların eş zamanlı saptanabilmesi

19. Y Kromozom Mikrodelesyonları • Erkek infertilitesi ile Y Kr.Mikrodelesyon ilişkisi : 1976 Tiepolo ve Zuffardi Y Uzun kolunda AZF bölgesi Gen bölgesi Aday Gen/genler AZFa USP9Y, DBY(Dead Box on the Y), UTY AZFb E1F1AY, RBMY AZFc DAZ, CDY1, BPY2, PRY AZFd DYS237 • Oligospermi - %6-8 • Azospermi - %3-15

20. AZF delesyon tiplerinin dağılımı

21. Y-Mikrodelesyonlarında Sperm Elde Etme

22. Y-Mikrodelesyonlarında Testis Histolojisi

23. Gr/gr Delesyonları • AZFc bölgesinde segmentler arasındaki Homolog Rekombinasyonlar sonucu • 21 gen delesyona uğrar • AZFc’de DAZ geninden 2 kopya, CDY1 den 1 kopya ve çeşitli transkripsiyon ünitelerinden de bazı kısımların delesyonu

24. AZFc • AZFc delesyonu olan erkeklerde zamana bağlı olarak sperm üretiminde azalma Simoni ve ark, Fertil Steril, 1997, 67:542-547 • AZFc delesyonu bilinen erkeklerde Kriyoprezervasyon yapılmalıdır. Krausz C ve ark, Hum Reprod, 1999, 14:1717-1721

25. AZF Duplikasyonları • 4 adet DAZ geni oluşumu ile giden duplikasyonlar Repping 2003, 2004 • AZFc parsiyel duplikasyonu erkek infertilitesinde bir risk faktörüdür. Lin ve ark., 2007, Hum Mutat • Azospermik ve Oligospermik hastalarda DAZ gen sayısında artış Writz ve ark., 2005, Fertil Steril

26. Y Kromozom Mikrodelesyonları • Klinik Önemi • Spermatogenezde ciddi bozulma • İnfertiliteye neden olan genetik hastalıklar arasında en sık tespit edilen bozukluk • Yardımla üreme teknikleri Üreme için tek şans • Sperm elde etmenin mümkün olmadığı durumlar(AZFa, AZFb) • Erkek çocukta da kalıtsal olarak Mikrodelesyon geçişi • Genetik bilgilendirme çok önemli!

27. EPİGENETİK

28. Gen Mutasyonları • Kistik fibroz gen mutasyonları • Konjenital bilateral vaz deferens agenezisi • İdiyopatik bilateral epididimal obstrüksiyon • Kallman sendromu (KAL-1) • Androjen reseptör gen mutasyonu • İmmotil silia sendromu • Polikistik böbrek hastalığı • Orak hücre anemisi ve talasemi

29. Kistik Fibrozis-CBAVD • Otozomal resesif geçiş • 1/2500 sıklık • Pulmoner ve pankreatik fonksiyon bozukluğu • 7q31 üzerinde ”Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) Geni” • CVAD’li hastaların %85’inde en az 1 CF gen mutasyonu • KF’li hastaların >%95 CBAVD nedeni ile infertil

30. Kistik Fibrozis-CBAVD • Klinik • Kronik pulmoner obstrüksiyon ve enfeksiyonlar • Pankreatik yetmezlik • Neonatal mekonyum ileusu • İnfertilite

31. Kistik Fibrozis-CBAVD • Muayene • Epididim gövde ve kuyruğu yok • Testis, caput epididim palpabl

32. Kistik Fibrozis Kromozom 7q.31.2>1200 mutasyonEn sık görülen 24 mutasyon Jarvi K, Chan PTK. In: “Reproductive Medicine Secrets”. 2004. Chan PTK. J Male Sex Reprod Health. 2002;2:161-164.

33. Kistik Fibrozis-CFTR • CFTR geni non-coding DNA bölgesinde İntron 8’in splicing alanında Polythymidine yolunda varyasyonlar, azalmalar (5T, 7T, 9T) • 5T azalması Splicingde azalma CFTR mRNA’da %50 azalma Matür ve fonksiyonel CFTR proteininde azalma

34. CFTR-Fertilite • Sperm kapasitasyonu için hücre içi pH ve Plazma membran hiperpolarizasyonu • Gerekli olan- Ekstraselüler HCO3- • Adenil siklaz aktivasyonu ve CAMP üretimi • Sonuç- CFTR spermde azalmış fertilizasyon kapasitesine neden oluyor. Xu MW ve ark, Proc Natl Acad Sci, June 2007

35. Kistik Fibrozis-CFTR • İdiyopatik Obstrüktif Azospermide ve Palpable Vaz Deferens %50 CFTR gen Mutasyonları • Öneri : CBAVD, CUAVD ve İdiyopatik Obstrüktif Azospermide CFTR taraması (5T)

36. Kistik Fibrozis-CBAVD Klinik Önemi • 1 partnerde CFTR mutasyonu var ise diğer partneri tara! • Erkekte CBAVD var ise kadın partneri tara! • CBAVD, CUAVD de renal hipoplazi ya da ageneziyi araştır!

37. Androjen Reseptör Gen Mutasyonları • 1/60.000 sıklıkta • AR’nin olmaması ya da fonksiyonel olarak farklılaşması • X Kromozomu üzerinde (Xq11-q12) • 300’den fazla mutasyon

38. Androjen Reseptör Gen Mutasyonları • AR – 8 exon • Exon 1 – CAG Tekrarı • Normal bireylerde 17-26 tekrar • Hasta bireylerde 40-52 tekrar • Tanı – PCR ile AR CAG tekrar bölgesinin incelenmesi

39. Erkek faktörüne Bağlı İnfertilitede GENETİK Hangi hastada hangi test? Non-obstrüktif azoospermi Karyotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi Şiddetli oligospermi Karyotip, Y-kromozom mikrodelesyon analizi CBAVD – obstrüktif azoospermi Kistik Fibrozis taraması– Genişletilmiş panel 5T analizi (Tek ya da çift taraflı vaz deferensyokluğu tespit edildiğinde)

40. İnfertilitede genetiğin rolü • Yanıt bekleyen sorular: • 1-Normal spermatogenezde, sperm maturasyonunda ve sperm fonksiyonlarında hangi genler rol oynamaktadır? • 2- İnfertiliteye yol açan polimorfizm ya da mutasyonlar nelerdir, bunları saptayarak hastaları daha iyi tedavi edebilir miyiz? • 3- Spermatogenez esnasında normal gen ekspresyonunu düzenleyen mekanizmalar nelerdir? • 4- Erkek infertilitesinde anormal mayotik rekombinasyon ya da ayrışma nasıl rol oynar? • 5- Embriyogenez üzerinde anormal DNA hasarlarının etkisi nedir?

41. SONUÇ • Daha ayrıntılı genetik ve moleküler çalışmalara ihtiyaç var • Yeni metodlar hızlı, tekrarlanabilir ve maliyeti kabul edilebilir olmalı