Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

1. Cours d'Hémato-cytologie DUT ABB 4- automatisation de l'Hémogramme Auteur : Bruno Flamand, IUT de Dijon

2. CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE L’HEMOGRAMME englobe: -les numérations des éléments figurés -le dosage de l’Hémoglobine -la mesure de l’Hématocrite -le calculs des constantes érythrocytaires et plaquettaires -l’établissement de la formule leucocytaire Prélèvement: sang veineux sur EDTA (ou citrate de Na), éventuellement sang capillaire L’Hémogramme est automatisé complètement ou partiellement dans les laboratoires

3. Numérations: GR, GB, Plaquettes. • Valeurs et constantes: • -érythrocytaires: • -Taux Hémoglobine sanguin Hb • -Hématocrite Ht • -Volume Globulaire Moyen VGM • -Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH • -Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH • -Indice de Distribution des Rouges IDR • -plaquettaires: • -Thrombocrite THT • -Volume Plaquettaire Moyen VPM • Indice de Distribution Plaquettaire IDP

4. Formule leucocytaire: répartition des différentes sous-populations de leucocytes: PN, PE,PB,L,M • -FL manuelle par lecture microscopique de frottis coloré au MGG (100 à 200 leucocytes répertoriés), si anomalie de FL automatisée • -FL automatisée (5000 à 10000 leucocytes répertoriés) • Les résultats sont rendus en valeur relative % et en valeur absolue par mm3, mais l’interprétation n’est valable que sur les valeurs absolues L’Hémogramme: NFS Numération Formule (leucocytaire) Sanguine • GR, Hb, Hte,VGM,TCMH,IDR: orientation du diagnostic des anémies • Plaquettes: diagnostic des pb d’hémostase primaire • GB, FL: diagnostic des pb infectieux, inflammatoires, leucémiques

5. Anciennes unités Facteur x Unités internationales Globules rouges 106 par mm3 106 T/L (téra, 1012) Hémoglobine g/100 ml 0,621 mmol/L Hématocrite % ou dl/dl 0,01 L/L VGM µ3 F/L (femto,10-15) TCMH pg 0,062 fmol (femto,10-15) CCMH % ou g/100ml 0,062 mmol/L Globules blancs 103 par mm3 106 G/L (giga, 109) Plaquettes 103 par mm3 106 G/L (giga, 109)

7. *La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans les anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d’anémie

8. Automatisation de l'hémogramme La chronologie par étapes Semi Auto GB Plt VGM GR Hb Hte Automates Numération Formule 3 pop. Formule 5 populations 22 par. + + (NFS) Rétic. Etaleur/Colorateur 7 par. - Plt 8 par. (+ Plt) 18 par. (HD) 1954 1972 1980 1990 1994 2000

9. Pentra 60 Horiba-ABX Sysmex XT Pentra 120 Retic Horiba-ABX ACT 5DIFF Beckman Coulter CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories Coulter HMX Beckman Coulter CELL-DYN SMS Abbot Laboratories

10. LH 1500 Series Automation Beckman Coulter CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories

11. LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES GR, GB, PLT Deux principes très différents: • La Variation d’impédance • Principe Coulter du nom des inventeurs (Wallace and Joe Coulter- 1953), Méthode de référence, la plus répandue. Utilisée pour les numérations, et la formule leucocytaire approchée. • La mesure optique • Associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977): • -focalisation hydrodynamique • -diffraction lumineuse recueillie à différents angles /incidence • Utilisée surtout pour la numération des GB associée à la FL, cependant quelques automates utilisent la mesure optique pour les numérations des 3 lignées GR, GB, PLT (Bayer automate ADVIA 120, Sysmex automate XT2000)

12. U Temps La variation d'impédancePrincipe Coulter I= constante Electrode interne U= R I et R = r l / s Vide régulé r: résistivité et l: largeur Bac de comptage Electrode externe 1 impulsion U = 1 particule Saphir percé d’un micro-orifice Flux de diluant conducteur Micro-orifice, surface s Impulsion La valeur de l’impulsion de tension U est proportionnelle au volume cellulaire Diamètre 4mm

13. Construction des histogrammes de distribution volumétrique: 1-amplification des impulsions (µV en mV)2-tri des impulsions selon des seuils électroniques3-Répartition des impulsions dans des canaux électroniques (256 ou 128) en fonction du niveau d’impulsion donc du volume cellulaire 4-comptage des impulsions dans un intervalle de volume cellulaire U = f(volume cellulaire) Histogramme de distribution volumétrique Seuil

14. Numération des Globules Rouges et des PlaquettesBac de comptage des GR/PLT • Comptage et mesure du volume à partir d'une suspension cellulaire diluée en solution isotonique: taux de dilution élevé (1/10 000 à 1/20 000 ), ce qui permet de rendre négligeable une interférence des GB • Un seul bac de comptage: • Toute particule d'un volume supérieur à 25 fl (et inférieur à 250 fl) est comptée comme un GR • Toute particule d’un volume supérieur à 2 fl (et inférieur à 25 fl) est comptée comme une PLT • Chaque particule est placée dans un histogramme de distribution volumétrique

15. Numération des Globules RougesHistogramme des GR Mise en évidence de fragments de cytoplasme ou de grandes plaquettes par l'analyse de l'histogramme à partir de 24 fl. VGM La trainée peut correspondre aux : • Passages en coïncidence • Agrégats cellulaires • Cellules agées • Globules blancs

16. 200 200 200 100 100 100 50 50 50 Numération des Globules RougesLes paramètres calculés Double population • L'IDR ou RDW (Red Cell Distribution Width) L'IDR est une valeur statistique correspondant au CV % calculé sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose. IDC Normal< 15% IDC Elevé 18 % IDC très Elevé 35 % • Ht = Hématocrite Ht = (GR 10 6/mm3 x VGM fl ) / 10 • TCMH = Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine. • TCMH en pg = (Hb g/100 ml / Nb GR) x 10 • CCMH = Concentration cellulaire moyenne en hémoglobine. • CCMH en % = (Hb en g/100 ml / Nb GR 10 6/mm3 x VGM) x 1000

17. Numération des PlaquettesHistogramme des PLT et paramètres calculés • Le Thrombocrite • TCT ou THT %= (VMP fl x Nb de Plaquettes 10 3/mm3 ) x 1000 • L'IDP ou PDW • Indice de distribution plaquettaire CV % sur la distribution volumétrique des PLT= coefficient d’anisocytose plaquettaire VMP Grandes Plaquettes > 20 fl Petites plaquettes, débris ? < 2 fl

18. Numération PLT Existent des seuils variablespermettant élimination risques d’interférences et numérations justes Débris Shizocytes GR microcytaires Petites plaquettes Grandes plaquettes

19. Numération des globules blancsBac de comptage des GB • Comptage à partir d'une suspension cellulaire diluée en liquide hémolytique: taux de dilution faible, (1/200 à 1/300) • Un bac de comptage réservé • Toute particule d'un volume supérieur à 35 fl est comptée comme un globule blanc. • Les globules rouges sont lysés (ammonium quaternaire, ferri cyanure, cyanure de K+), permet la libération de Hb CyanMetHb • Une partie de la dilution des leucocytes passe dans une cuve spectrophotométrique pour la mesure à 540 nm Photo-détecteur Source lumineuse LED Filtre Cuve de mesure

20. U Temps Correction de passage en coïncidence Doublet ou triplet cellulaires • Le résultat de numération est assujeti à une correction dite "correction de coïncidence". • Occasionnellement deux ou trois cellules peuvent traverser l'orifice de comptage en même temps. • Une impulsion de grande amplitude est générée. • La fréquence de ces passages en coïncidence est statistiquement prévisible en fonction du nombre de cellules. Cette correction est réalisée automatiquement par les analyseurs.

21. LA FORMULE LEUCOCYTAIRE automatiséeTROIS POPULATIONS ou CINQ POPULATIONS (5 Diff) • La formule leucocytaire 3 populations ou formule approchée, (GRA / Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules blancs, après lyse des GR, et action différentielle d’une lyse ménagée sur les GB, lyse qui modifie leur volume. • Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur fonctionnelle, un automate de ce type décharge l’automate principal du passage de sangs de patients sans anomalie • La FL complète ou 5 populations, permet en associant plusieurs principes technologiques, l’analyse des GN, GE, GB, M, L, et le repérage facilité de populations anormales du sang (lymphocytes atypiques, cellules immatures précurseurs, érythroblastes…)

22. Il est des circonstances où il faut effectuer obligatoirement une formule au microscope, et ne pas se contenter de la formule de l’automate: • FL du nouveau-né • Premier examen d’un malade avec nettes anomalies de numération • Variations brutales et inexpliquées par rapports aux NF antérieures • Incohérence avec le contexte clinique ou thérapeutique • Alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication évidente au vu du dossier et/ou des examens antérieurs • Alarmes de l’automate pour distribution cellulaires inhabituelles sur les graphes

23. Formule 3 populationsRôle de la lyse différentielle (Cytolyse ménagée) La membrane devient semi-perméable Le contenu cytoplasmique est libéré La membrane cytoplasmique se rétracte autour du noyau et des granulations Le volume final dépend de la taille du noyau, de sa lobularité et des granulations.

24. Lymphocyte, 30 à 100 fl Granuleux, 160 à 450 fl Mono 100 à 160 fl Alarme L1: agrégats PLT, Erythroblastes Alarme M2, G1: Précurseurs Granulocytes, Eosinophilie Histogramme différentiel volumétrique de GB Détermination de 3 sous-populations Reconnaissance des cellules d'après le volume résultant, par variation d’impédance 3 sous populations : Lymphocytes, Monocytes, Granulocytes. Les anomalies de distribution sont signalées par des alarmes.

25. Formule Leucocytaire 5 populations • Analyse automatisée individuelle des caractéristiques cellulaires naturelles ou modifiées d’un seul leucocyte  PERFORMANCE • Analyse sur un nombre élevé de leucocytes (5000 à 10000):  PRECISION de la FL automatisée par rapport à FL microscopique • Circulation des GB , après hémolyse des GR, individuellement, séparés, dans un système liquide de flux laminaire: Focalisation Hydrodynamique ou gainage cellulaire, principe de base de la technologie de CytoMétrie en Flux (CMF) • Apparition successive des GB indivualisés dans un ensemble de mesure, permettant une analyse optique simultanée de plusieurs paramètres naturels (volume cellulaire, présence de granulation, hétérogénéité du noyau) ou modifiés (coloration, fluorescence) de la cellule. • (CFM = FACS « Fluorescence Activated Cell Sorter »)

26. Flux de gainage Flux de gainage Flux de gainage Flux échantillon Flux échantillon Hydrofocalisation FOCALISATION HYDRODYNAMIQUE -   Suspension cellulaire exposée à une surpression (1 bar) injectée au centre d'une veine liquide d'entraînement (liquide de gainage) circulant à une vitesse différente -   Sortie de la suspension cellulaire par un rétrécissement d'un micro-orifice 50 µm à 300 µm -   Absence de mélange "Suspension cellulaire/ liquide de gainage" car densité du liquide de gainage > densité du liquide suspension cellulaire -   Ecoulement laminaire des cellules: 500 à 5000 cellules/sec, 25 à 36 km/H, séparation ≥ 1mm, orientation des cellules selon leur plus grand axe dans le flux, et déformation cellulaire uniforme en fonction de la cellule

27. Diluant Diluant SOURCE Cellule photoélectrique Diluant Diluant Echantillon La mesure optique Diffraction lumineuse La cellule passe individuellement devant un faisceau lumineux conventionnel (lampe halogène à vapeur de Hg ou de Xe) ou LASER (Argon, Kryton-Argon, Helium-Neon…)

28. Diffraction lumineuse Intensité de la lumière diffractée peut être corrélée à des caractéristiques morphologiques cellulaires: - Intensité de la lumière diffractée par la cellule, recueillie dans l'axe de la lumière incidente, dite "diffraction aux petits angles" (2 à 6°), (FALS Forward Angle Light Scatter, ou FSC Forward Scatter Channel), est en relation proportionnelle avec la taille cellulaire , la forme cellulaire, et l’indice de réfraction cellulaire - Intensité de la lumière diffractée par la cellule, recueillie de 8° à 90° de l'axe de la lumière incidente, "diffraction aux grands angles", (RALS Right Angle Light Scatter, ou SSC Side Scatter Channel), est relation proportionnelle avec l'hétérogénéité du contenu cellulaire, présence/absence et taille de granulation cytoplasmique, forme et taille du noyau, rapport N/C, densité chromatinienne du noyau, ce Paramètre est appelé « Granularité» Détection aux petits angles : Taille Détection aux grands angles: « Granularité »

29. Formule 5 Populations : critères de reconnaissanceLes automates associent divers principes technologiques permettant l’accès à divers critères de reconnaissance • Variation Impédance (= Volume cellulaire) Principe Coulter pour le volume, ou mesure optique pour la taille • Diffraction lumineuse (= taille cellulaire et Granularité) Diffraction de la lumière par la cellule (différents angles) • Cytochimie sélective Coloration d’un élément de la cellule, par simple affinité (ex:coloration des granulations éosinophiles) ou par activité enzymatique chromogène sélective (ex: peroxydase des granulations) • Conductivité (opacité) Courant Radio Haute Fréquence (RF) Structure de la cellule par un conduction courant haute fréquence • Cytolyse Lyse sélective de populations. Ex: tous les GB sauf PB. (évidemment dans tous les cas de FL complète automatisée, la lyse de GR est obligatoire

30. Détermination de la formule 5 populationsChaque société sur ses automates combine plusieurs technologies et donc plusieurs critères de reconnaissance • Impédance + Conductivité HF + Diffraction lumineuse BeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500, LH750 • Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Actvité peroxydasique) BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon H2, H3 • Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulationsEo.) HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120 BayerDiagnostics Automates Advia70 BeckmanCoulter Automates ACT 5Diff • Diffraction lumineuse + Cytochimie (Eosino) + Cytolyse Sysmex SF3000, XE2100 • Diffraction lumineuse multi-angulaire sans cytolyse AbbottDiagnostics Automates CELL-DYN 3200, 3700, 4000

31. Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie Lampe tungstène Absorption lumineuse Matrice LMNE Liquide de gainage Volume Saphir Double Focalisation hydrodynamique Traitement des cellules coloration des granulations Eosinophiles (noir chlorazol)

32. Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie MATRICE LMNE

33. Horiba ABXImpédance/Cytolyse/Cytochimie Histogramme volumétrique Basophiles Saphir • Traitement des cellules : • Lyse de tous les blancs sauf des Basophiles Mesure du Volume par variation d’impédance

34. Absorbance Eo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bruit de fond Ne . . GCI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . GCI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mo+Ba . . . . . Ly . . . . . . . . . . Volume LyA Horiba ABXImpédance/Cytolyse/Cytochimie Matrice LMNE Nombre Basophiles Noyaux GB Volume Histogramme Basophiles

35. Horiba ABX Impédance/Cytolyse/Cytochimie

36. Exemple d’hémogramme complet sur Pentra Horiba ABX

37. Beckman CoulterImpédance/ConductivitéHF/Diffraction Mesures optiques V o l u m e Saphir: Mesure d’impédance Conductivité noyau Mesure Volume Diffraction : Surface,granulations Mesure Conductivité courant radio haute fréquence Diffraction lumineuse Rotated Light Scatter angle 10° à 70° =(Granularité)

38. Beckman CoulterImpédance/Conductivité/Diffraction M PE M GRA L PN L Diffraction Conductivité M PB Soustraction des coordonnées « Diffraction » des PN, PE, du nuage GRA, pour « révéler PB » L

39. Volume Mo Ne Eo Ba Ly Conductivité Diffraction Beckman CoulterImpédance/ConductivitéHF/Diffraction Analyse en 3D

40. Exemple d’hémogramme complet sur Beckman Coulter HmX

41. Abbott DiagnosticsDiffraction Laser multi-angulaire Laser ARGON Granulations Eosinophiles PMT1 90° ,Dépolarisée 90°, Polarisée PMT2 Conplexité du cytoplasme Complexité du noyau 7° Numération Taille 0°

42. Abbott Diagnostics Diffraction Laser multi-angulaire Angles de diffraction et critères de reconnaissance 90°Pol/ 90°dep Granulations 10° Structure 1°/3° (0°) Taille Faisceau laser Polarisation 1°/3° (0°) Taille 10° Structure

43. Abbott DiagnosticsDiffraction Laser multi-angulaire Diffractogrammes 90 ° Dépolarisé Taille Ne+Eo Mo Eo Ly Ba Ne Débris Structure 90° Polarisé

44. LA NUMERATION AUTOMATISEE DES RETICULOCYTES Exemple sur automate Pentra 120Rétic Horiba ABX Marquage fluorescent des ARN résiduels Fluorochrome: Thiazole orange Focalisation dans cellule de mesure, d’une dilution sanguine 1/3000 dans diluant isotonique + thiazole orange 2 informations recueillies: -comptage et volume par impédance (saphir) -signal d’intensité de fluorescence OFL émise à 530 nm, déclenché par excitation transitoire, recueillie à 90° du trajet optique

45. Matrice Réticulocytes Pentra 120 Horiba ABX Réticulocytes à fluorescence élevée OFL Intensité Fluorescence Réticulocytes à fluorescence moyenne Réticulocytes à fluorescence faible GR matures Volume

47. Bayer-TechniconDiffraction/Cytolyse/CytochimieDiffraction lumineuse enregistrée sous deux angles différents Matrice PEROX Miroir semi-transparent Petit angle 2/3° = Taille Lentille Lampe tungstène-vapeur Halogène Lentille Grand angle 5/15°=Activité Peroxydasique Miroir semi-transparent Traitement des cellules : substrat chromogène révélateur de l'activité peroxydasique Cellule photoélectrique

48. Bayer-TechniconDiffraction/Cytolyse/Cytochimie Diagramme Basophiles Miroir semi-transparent Petit angle 2/3° = Taille Lentille Laser Lentille Grand angle 5/15°=Densité chromatinienne Traitement des cellules ; Lyse de tous les G.blancs sauf des P.basophiles Cellule photoélectrique Miroir semi-transparent

49. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Bayer-TechniconDiffraction/Cytolyse/CytochimieDiagramme Perox et Diagramme Basophiles Diagramme BASOS Diagramme PEROX Taille Taille Neutrophiles . LUC . . . . . . . . . BASOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Mo . Ly Noyaux monolobés Noyaux Polylobés Eosinophiles Débris Densité Chromatinienne /Segmentation Activité peroxydase

50. SysmexVolume/RF/Cytolyse Diagramme RF/Volume Impulsion RF Courant haute fréquence Courant continu ~ Source fréquence radio Impulsion impédance Saphir Sonde radio-fréquence Condensateur • Traitement des cellules : • Lyse différentielle et partielle des blancs.