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Automatisation de l'Hémogramme NFS

Automatisation de l'Hémogramme NFS. CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE. L’HEMOGRAMME englobe: -les numérations des éléments figurés -le dosage de l’Hémoglobine -la mesure de l’Hématocrite -le calculs des constantes érythrocytaires et plaquettaires -l’établissement de la formule leucocytaire

sylvain
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Automatisation de l'Hémogramme NFS

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  1. Automatisation de l'Hémogramme NFS

  2. CYTOLOGIE HEMATOLOGIQUE L’HEMOGRAMME englobe: -les numérations des éléments figurés -le dosage de l’Hémoglobine -la mesure de l’Hématocrite -le calculs des constantes érythrocytaires et plaquettaires -l’établissement de la formule leucocytaire Prélèvement: sang veineux sur EDTA (ou citrate de Na), éventuellement sang capillaire L’Hémogramme est automatisé complètement ou partiellement dans les laboratoires

  3. Numérations: GR, GB, Plaquettes. • Valeurs et constantes: • érythrocytaires: • -Taux Hémoglobine sanguin Hb • -Hématocrite Ht • -Volume Globulaire Moyen VGM • -Concentration Corpusculaire Moyenne en Hb CCMH • -Taux Corpusculaire Moyen en Hb TCMH • -Indice de Distribution des Rouges IDR • plaquettaires: • -Thrombocrite THT • -Volume Plaquettaire Moyen VPM • Indice de Distribution Plaquettaire IDP

  4. leucocytaire: NFS Numération Formule (leucocytaire) Sanguine • Formule leucocytaire: répartition des différentes sous-populations de leucocytes: PN, PE,PB,L,M • -FL manuelle par lecture microscopique de frottis coloré au MGG (100 à 200 leucocytes répertoriés), si anomalie de FL automatisée • -FL automatisée (5000 à 10000 leucocytes répertoriés) • Les résultats sont rendus en valeur relative % et en valeur absolue par mm3, mais l’interprétation n’est valable que sur les valeurs absolues • GR, Hb, Hte,VGM,TCMH,IDR: orientation du diagnostic des anémies • Plaquettes: diagnostic des pb d’hémostase primaire • GB, FL: diagnostic des pb infectieux, inflammatoires, leucémiques

  5. Anciennes unités Facteur x Unités internationales Globules rouges 106 par mm3 106 T/L (téra, 1012) Hémoglobine g/100 ml 0,621 mmol/L Hématocrite % ou dl/dl 0,01 L/L VGM µ3 F/L (femto,10-15) TCMH pg 0,062 fmol (femto,10-15) CCMH % ou g/100ml 0,062 mmol/L Globules blancs 103 par mm3 106 G/L (giga, 109) Plaquettes 103 par mm3 106 G/L (giga, 109)

  6. *La CCMH est considérée comme un indice moins sensible de l’hypochromie que la TCMH dans les anémies, en effet la TCMH diminue avant la CCMH dans l’installation d’un cas d’anémie

  7. Pentra 60 Horiba-ABX Sysmex XT Pentra 120 Retic Horiba-ABX ACT 5DIFF Beckman Coulter CELL-DYN 3700 Abbot Laboratories Coulter HMX Beckman Coulter CELL-DYN SMS Abbot Laboratories

  8. LH 1500 Series Automation Beckman Coulter CELL-DYN WorkCell Abbott Laboratories

  9. LA NUMERATION DES TROIS LIGNEES GR, GB, PLT Deux principes très différents: • La Variation d’impédance • Principe Coulter du nom des inventeurs (Wallace and Joe Coulter- 1953), Méthode de référence, la plus répandue. Utilisée pour les numérations, et la formule leucocytaire approchée. • La mesure optique • Associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977): • -focalisation hydrodynamique • -diffraction lumineuse recueillie à différents angles /incidence • Utilisée surtout pour la numération des GB associée à la FL, cependant quelques automates utilisent la mesure optique pour les numérations des 3 lignées GR, GB, PLT (Bayer automate ADVIA 120, Sysmex automate XT2000)

  10. 200 200 200 100 100 100 50 50 50 Numération des Globules RougesLes paramètres calculés Double population • L'IDR ou RDW (Red Cell Distribution Width) L'IDR est une valeur statistique correspondant au CV % calculé sur la distribution des rouges = coefficient d'anisocytose. IDC Normal< 15% IDC Elevé 18 % IDC très Elevé 35 % • Ht = Hématocrite Ht = (GR 10 6/mm3 x VGM fl ) / 10 • TCMH = Teneur cellulaire moyenne en hémoglogine. • TCMH en pg = (Hb g/100 ml / Nb GR) x 10 • CCMH = Concentration cellulaire moyenne en hémoglobine. • CCMH en % = (Hb en g/100 ml / Nb GR 10 6/mm3 x VGM) x 1000

  11. Numération des PlaquettesHistogramme des PLT et paramètres calculés • Le Thrombocrite • TCT ou THT %= (VMP fl x Nb de Plaquettes 10 3/mm3 ) x 1000 • L'IDP ou PDW • Indice de distribution plaquettaire CV % sur la distribution volumétrique des PLT= coefficient d’anisocytose plaquettaire VMP Grandes Plaquettes > 20 fl Petites plaquettes, débris ? < 2 fl

  12. LA FORMULE LEUCOCYTAIRE automatiséeTROIS POPULATIONS ou CINQ POPULATIONS (5 Diff) • La formule leucocytaire 3 populations ou formule approchée, (GRA / Lympho / Mono): pour la majorité des automates, elle est réalisée par analyse par variation d’impédance des volumes cellulaires des globules blancs, après lyse des GR, et action différentielle d’une lyse ménagée sur les GB, lyse qui modifie leur volume. • Cette FL approchée n’a pas de valeur légale, et très peu de valeur fonctionnelle, un automate de ce type décharge l’automate principal du passage de sangs de patients sans anomalie • La FL complète ou 5 populations, permet en associant plusieurs principes technologiques, l’analyse des GN, GE, GB, M, L, et le repérage facilité de populations anormales du sang (lymphocytes atypiques, cellules immatures précurseurs, érythroblastes…)

  13. Il est des circonstances où il faut effectuer obligatoirement une formule au microscope, et ne pas se contenter de la formule de l’automate: • FL du nouveau-né • Premier examen d’un malade avec nettes anomalies de numération • Variations brutales et inexpliquées par rapports aux NF antérieures • Incohérence avec le contexte clinique ou thérapeutique • Alarmes de l’automate pour lesquelles il n’y a pas d’explication évidente au vu du dossier et/ou des examens antérieurs • Alarmes de l’automate pour distribution cellulaires inhabituelles sur les graphes

  14. Formule Leucocytaire 5 populations • Analyse automatisée individuelle des caractéristiques cellulaires naturelles ou modifiées d’un seul leucocyte  PERFORMANCE • Analyse sur un nombre élevé de leucocytes (5000 à 10000):  PRECISION de la FL automatisée par rapport à FL microscopique • Circulation des GB , après hémolyse des GR, individuellement, séparés, dans un système liquide de flux laminaire: Focalisation Hydrodynamique ou gainage cellulaire, principe de base de la technologie de CytoMétrie en Flux (CMF) • Apparition successive des GB indivualisés dans un ensemble de mesure, permettant une analyse optique simultanée de plusieurs paramètres naturels (volume cellulaire, présence de granulation, hétérogénéité du noyau) ou modifiés (coloration, fluorescence) de la cellule. • (CFM = FACS « Fluorescence Activated Cell Sorter »)

  15. Formule 5 Populations : critères de reconnaissanceLes automates associent divers principes technologiques permettant l’accès à divers critères de reconnaissance • Variation Impédance (= Volume cellulaire) Principe Coulter pour le volume, ou mesure optique pour la taille • Diffraction lumineuse (= taille cellulaire et Granularité) Diffraction de la lumière par la cellule (différents angles) • Cytochimie sélective Coloration d’un élément de la cellule, par simple affinité (ex:coloration des granulations éosinophiles) ou par activité enzymatique chromogène sélective (ex: peroxydase des granulations) • Conductivité (opacité) Courant Radio Haute Fréquence (RF) Structure de la cellule par un conduction courant haute fréquence • Cytolyse Lyse sélective de populations. Ex: tous les GB sauf PB. (évidemment dans tous les cas de FL complète automatisée, la lyse de GR est obligatoire

  16. Détermination de la formule 5 populationsChaque société sur ses automates combine plusieurs technologies et donc plusieurs critères de reconnaissance • Impédance + Conductivité HF + Diffraction lumineuse BeckmanCoulter Automates MAXM, HmX, GenS, LH500, LH750 • Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Actvité peroxydasique) BayerDiagnostics Automates Advia120, Technicon H2, H3 • Impédance + Cytolyse + Cytochimie (Coloration des granulationsEo.) HoribaAbx Automates Pentra60, Pentra80, Pentra120 BayerDiagnostics Automates Advia70 BeckmanCoulter Automates ACT 5Diff • Diffraction lumineuse + Cytochimie (Eosino) + Cytolyse Sysmex SF3000, XE2100 • Diffraction lumineuse multi-angulaire sans cytolyse AbbottDiagnostics Automates CELL-DYN 3200, 3700, 4000

  17. Exemple d’hémogramme complet sur Pentra Horiba ABX

  18. Exemple d’hémogramme complet sur Beckman Coulter HmX

  19. RéticulocytesNouveau bleu de méthylène

  20. LA NUMERATION AUTOMATISEE DES RETICULOCYTES Exemple sur automate Pentra 120Rétic Horiba ABX Marquage fluorescent des ARN résiduels Fluorochrome: Thiazole orange Focalisation dans cellule de mesure, d’une dilution sanguine 1/3000 dans diluant isotonique + thiazole orange 2 informations recueillies: - comptage et volume par impédance (saphir) - signal d’intensité de fluorescence OFL émise à 530 nm, déclenché par excitation transitoire, recueillie à 90° du trajet optique

  21. Matrice Réticulocytes Pentra 120 Horiba ABX Réticulocytes à fluorescence élevée OFL Intensité Fluorescence Réticulocytes à fluorescence moyenne Réticulocytes à fluorescence faible GR matures Volume

  22. PATHOLOGIE LEUCOCYTAIRE I - Polynucléoses neutrophiles • Definition: • =>neutrophiles >7-8000/mm3 • Variations physiologiques: • grossesse, menstruations • effort physique, digestion, stress +++ • Nouveau-né • Etiologies: • 1) Infections Bactériennes: • étatfébrile, splénomégalie, HC+ • infections généralisées: • septicemies • endocardites • infections focalisées: • abcescutané • infections dentaires+++, ORL++ • infections profondes: gyneco....... • 2) Maladies Inflammatoires: • artérites: Horton, PAN • rhumatismales: PR, myosite • goutte • 3) Cancers et hémopathies: • métastasesintramedullaires =>polynucléose+++ avec myélemie • Leucémiemyéloidechronique • 4) Nécrosestissulaires: - infarctus... • 5) Régénérationmédullaire intense • 6) Tabagisme+++ • 7) Prisesmédicamenteuses: • Corticoides et Adrenaline • lithium, héparine • qqstoxiqueshémolysants ( Plomb, benzène) • 8) Maladies Métaboliques: • Insuffisancerénale • acidosediabétique • Cushing

  23. II - Myélémies Definition: présence dans le sang d'éléments immatures de la lignée granuleuse myélémie pure ou associée à une érythoblastémie 3- Un syndrome myéloprolifératif: leucémie myéloide chronique leucémie myélo-monocytaire chronique thrombocythémie essentielle polyglobulie rarement 4- Une myélofibrose: splénomégalie myéloide: splénoM + erythroblastémie++ myélofibrose aigue primitive myélofibrose II à un envahissement médullaire (sans PNose): LA lymphoblastique type L3 myélodysplasie Hodgkin, Lymphome cancers tuberculose Etiologies: 1- Réactionnelles:(< 10 %) sepsis sévère tuberculose aigue syndrome inflammatoire 2- Régénératives: hémorragie aigue hémolyse sortie d'aplasie, agranulocytose corticothérapie facteur de croissance

  24. III - Hyperéosinophilies Definition: Eosinophiles >350-500-800/mm3 sur pls examens successifs Etiologies: 1) Parasitoses: parasites à migration tissulaire=> l'Eosinophile joue un role dans les défenses contre le parasite: Eosinophilie fluctuante en coup d'archer. Quelle parasitose? Europe: ascaris, taenia, distomatose, oxyurose, larva migrans, hydatidose Antilles: bilharziose, anguillulose, ankylostomose Afrique: filariose, loase, onchocercose

  25. III - Hyperéosinophilies 2) Allergiques: car les enzymes du P.Eosinophile limitent la réaction anaphyllactique terrain atopique personnel ou familial: asthme, rhinite, conjonctivite... cutané: urticaire, eczéma alimentaire... vascularite allergique medicaments : penicillines, sulfamides , protéines injectables (extrait de foie) vaccins , produit de contraste iodé 3) Cancers et Hemopathies: Hodgkin LMC à forme hyperEo LAM2 Eo LAI Lymphomes malins (sécrétion ESF) cancers à nécrose tumorale

  26. III - Hyperéosinophilies 4) Collagenoses • vascularites : Périartérite noueuse, LED, angéites allergiques (Churg-Strauss,Wegener.......) • LED, dermatopolymyosite, PR • fasciites à éosinophiles (Shulman) • sarcoïdose, oedème angioneurotique  5) Dermatoses prurigineuses • parasitose (gales) • pemphigus, dermatite herpétiforme • toxidermie 6) Causes diverses • irradiation • brûlure • splénectomie • pancréatite aigue

  27. Sdd'HyperEosinophilieEssentielle definition: Eosinophilie > 1500/mm3 pendant > 6 mois idiopathique   risque à complications multiviscérales graves liées à la toxicité des Eo dans les tissus • pulmonaire • neurologique (neuropathie périphérique) • myosite et fasciite • cardiaque (Endocardite de Loëffler)

  28. IV - Lymphocytoses isolées Définition : lymphocytes > 4000/mm3 chez l’adulte > 6000/mm3 chez l’enfant > 11000/mm3 chez le NNé Eliminer: 1- les fausses  hyperlymphocytoses "inversion de formule " 2 - les lymphocytes anormaux • leucoblastes • cellules de Sezary • cellules lymphomateuses • tricholeucocytes • sd MNI

  29. Lymphocytoses isolées Diagnostic étiologique: se discuteselonl'âge à chez l'enfant :à BENIGNES • Viroses : oreillons, rougeole, rubéole, varicelle, HV Coqueluche • Hyperlymphocytosebénigne de CARL-SMITH • Post-vaccinale, ouréactionimmuno-allergiquemédicamenteuse. à chez l'adulte : Rarementbénin aigues : Infections brucellose, typhoïde Chroniques: allergies médicamenteuses , insuffisancesurrénalienne, hypophysaire, Addison thyréotoxicose , aspléniefonctionnelle , maladies auto-immunes , tabac (F age moyen, HLADR7, Lymphobinucléés) à tréssouvent: Hémopathiesmalignes+++ • leucémielymphoidechronique • Waldenström • lymphomemalinleucémisé :

  30. V- Syndromes mononucléosiques Définition :présencedans le sang de grandes cellules mononucléées: grands lymphocytes activéshyperbasophiles +++ = lymphocytes T cytotoxiquescontre des: • cellules infectées(Virus, Bactéries, Parasites) • cellules étrangères(Reaction de rejet) • Ag étrangers(penicilline) Ex. : MNI : les lymphocytes B sontinfectés par EBV puislysés par les T cytotoxiquesactivés Diagnostic + :reconnaître le sdmononucléosiquesur NFS - grands lymphocytes bleutés +++  5 à 90 % , +/- hyperlymphocytose 10 à 25000/mm3 GR et plaquettesnormaux Diagnostic différentiel : sur la NFS : • présence de lymphoblastes (LAL) • grands lymphocytes non basophiles

  31. Quelle est sa cause? 1) Causes infectieuses : Virales * MNI(EBV): 85 % des sdmononucléosiques: fièvre + asthénie + angine + rash Dg : MNI test+ Paul Bunnel + IgM EBV * CMV: 5 % asymptomatiques post-transfusionnel *primo-infestation HIV Parasitaires * Toxoplasmose : < 1 % (contact avec des chats ouviande mal cuite) adénopathiescervicales +++ sans angine * paludisme Autres causes infectieuses: Virosesdiverses: (HVB, HSV, HIV, rubéole, VZV, rougeole, oreillons...) infections à germesintracellulairesà Rickettsiose, brucellose,  typhoïde, syphilis 2) R. immunologiques: • immuno-allergiques(péni,sulfamides) • greffes • maladies autoimmunes : LED

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