Enzimas de resricción (tijeras moleculares)

1. Permiten manipular el ADN (Cortar, aislar, secuenciar, clonar y pegar) de un organismo donante para introducirlo en otro, utilizando un vector Enzimas de resricción (tijeras moleculares) Nathans D., Arber W., y Smith H. (premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1978 por el descubrimiento de las enzimas de restricción y su aplicación en Genética Molecular)

2. ADN RECOMBINANATE (enzimas) Es cualquier moléculas de ADN formada por la unión de segmentos de ADN de origen diferente. Enzima de restricción (o endonucleasas de Restricción) es una enzima, sintetizada por bacterias para proteger su ADN del ADN invasor, y que puede reconocer una secuencia característica de nucleótidos dentro de una molécula de ADN y cortar el ADN en ese punto. Los fragmentos de ADN obtenidos de este modo pueden unirse por sus extremos por otras enzimas llamadas ligasas.

4. Molécula A Molécula B Digestión de ambas moléculas con la misma enzima de restricción, BamHI Extremos cohesivos Mezclar Tratar con ADN-ligasa ADN recombinante

5. Análisis de fragmentos de ADN La Electroforesis es unatécnica analítica de separación de moléculas cargadas eléctricamente, debido a la diferente movilidad que presentan cuando son sometidas a un campo eléctrico. Se pueden separar fragmentos de ADN o ARN, en un gel de agarosa, obteniéndose un patrón de bandas dependiendo del tamaño de los distintos fragmentos.

6. Separación de los fragmentos de ADN (electroforesis)

7. Huella genética Técnica utilizada para distinguir entre los individuos de una misma especie. Se basa en se analizar zonas del ADN altamente variables o microsatélites (distinta repetición y con diferente grado de recombinación debido a la inestabilidad del locus). Estas zonas se cortan en piezas de diferentes tamaños usando enzimas de restricción. Se obtienen un bandeado característico en la técnica de electroforesis. Estos fragmentos se pueden analizar al utilizar sondas genéticas.

8. Hibridación con sondas de ADN La hibridacióno renaturalización de ácidos nucleicos, es un proceso por el cuál se combinan una cadena sencilla con una secuencia de bases complementaria en una única molécula. Esto permite identificar la presencia de un gen que codifica una proteína específica. Sonda de ADN Es un fragmento artificial de ADN de cadena sencilla marcada con radiactividad o fluorescencia, y cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a la secuencia del gen que se desea detectar. Biochips. Son láminas de vidrio donde se fija en cada una de sus celdillas una cantidad ínfima de fragmentos de ADN de cadena simple y que actúa como sonda para un gen determinado. Se utilizan para: Detectar mutaciones (genes de enfermedades, etc.). Controlar la expresión de genes (líneas cancerosas) Diagnosticar enfermedades infecciosas. Personalizar el tratamiento con medicamentos. Sugerir nuevas técnicas diagnósticas o terapéuticas.

9. SONDA Y BIOCHIP

10. En el campo de la Ingeniería genética consiste en aislar y multiplicar un gen, o en general, un trozo de ADN. Utilizando un vector de clonación (plásmido, con un gen resistente a un antibiótico) y su posterior inserción y expresión en bacterias. En Animales superiores consiste en obtener un individuo a partir de una célula o de un núcleo de otro individuo ¿Qué es la clonación? Obtención de organismos genéticamente idénticos

11. Inserción de los fragmentos de ADN (vectores de clonación) Inserción de los fragmentos de ADN (vectores de clonación) • Plásmidos • Plásmidos Plásmido 2 3 Extremos cohesivos Molécula de ADN recombinante 1 gen de resistencia a la ampicilina

12. Introducción del vector (Obtención de un clon celular) Plásmido

13. Inserción de los fragmentos de ADN (vectores de clonación) • Virus 2 3 1

14. (g) (f) (h) Ciclo lítico Introducción del vector (Obtención de un clon celular) Ciclo lisogénico

15. Genotecas (bibliotecas genómicas) Genoma de hongos: 44 millones de pares de bases Huésped: Escherichia coli Vector: Bacteriófagos capacidad: 20 mil pares de bases Genoma humano: 3000 millones de pares de bases Huésped:Saccharomyces cerevisiae Vector: YAC (cromosoma artificial de levadura) MegaYAC (capacidad: 1 millón de pares de bases)

16. En 1983 Kary Mullis da a conocer esta técnica y en 1993 recibió el Premio Nobel de Química por este descubrimiento Es un proceso cíclico (cada ciclo consta de 3 pasos) 94ºC desnaturalización (separación de las dos hebras de ADN) 50ºC Anillamiento de "cebadores" 72ºC copia de cada una de las hebras de ADN por la ADN polimerasa 35 ciclos 236= 68 billones de copias

17. ACTTTGTCCACGGCCTAAGCGTTTTTTGCCC AGTGACTTTGTCCAAC GTCCAACAGTTACCAAGTGACTTTGTCCAC TTTTGCCC AGTGACTTTGTCCA ACGGCCTAAGCGTTTTTTTT ALINEAMIENTO DE TODAS LAS SECUENCIAS Y RECONSTRUCCIÓN DEL CROMOSOMA Secuenciación de genomas Secuenciación automática del ADN

18. Aplicaciones de la secuenciación de ADN • Detección de mutaciones • Método de diagnóstico rutinario (relación entre enfermedad y mutación puntual) • Secuenciación de ADNs fósiles • Posibilidad de aislar secuencias de ADN a partir de unas pocas copias (la mayoría • están dañadas o degradadas) • Diagnóstico de enfermedades genéticas • Diagnóstico prenatal / Diagnóstico preimplantación de enfermedades hereditarias o determinación del sexo del feto previamente a su implantación en procesos de • fecundación in vitro • Identificación de especies y control de cruces entre animales • Para descubrir fraudes comerciales, tales como vender carne de una especie más • barata a los precios de otra más cara, o el comercio ilegal de especies en peligro • Secuenciación de genomas • Conocimiento básico y aplicado de diferentes organismos (incluido el genoma humano)

19. TÉCNICAS DE INGENIERÍA GENÉTICA • Son un conjunto de procedimientos que permiten la manipulación del ADN de un organismo para conseguir nuevas formas de vida con combinaciones únicas de genes adecuadas a las necesidades humanas. • Mediante Ingeniería genética se puede transferir genes entre especies distintas, es decir de un organismo a cualquier otro. Con objeto de obtener organismos genéticamente modificados (OGM) o transgénicos, terapia génica, etc.

20. ORGANISMOS GENÉTICAMENTE MODIFICADOS • Son organismos (bacterias, hongos, animales, plantas, etc., que contienen un gen procedente de otro organismo o transgen. • Para introducir el transgen en un organismo determinado se utilizan vectores de expresión o vehículos de transporte, como virus o plásmidos bacterianos

21. Aplicaciones de los organismos genéticamente modificados • Microorganismos: • Productos industriales farmacéuticos y médicos: • Enzimas • Antibióticos • Proteínas humanas (insulina) • Mejora del medio ambiente. • Biorremediación. • Eliminación de metales pesados • Producir bioconbustibles. • Descomposición de plásticos biodegradables.

22. Aplicaciones de la ingeniería genética aplicaciones médicas Obtención de proteínas de interés médico, comercial, etc... (insulina, hormona del crecimiento, factores de coagulación antes se obtenían a partir de los tejidos que las producen o fluidos corporales)

23. Extracción del ADN del virus Integración del plásmido híbrido en el núcleo de una célula de levadura ADN plásmido bacteriano La levadura fabrica las proteínas víricas con poder inmunológico Inyección de proteínas víricas en un chimpancé Aplicaciones de la ingeniería genética aplicaciones médicas Obtención de vacunas recombinantes (aternativa al uso de organismos patógenos inactivos)

24. Biochip Microarray DNAchip Aplicaciones de la ingeniería genética aplicaciones médicas Mediante ingeniería genética se construye una sonda de ADN, marcada (marcaje fluorescente), con la secuencia complementaria del ADN enfermo Diagnóstico de enfermedades de origen genético ADN sano ADN enfermo ADN complementario del ADN enfermo Conocimiento previo de la secuencia de ADN enfermo DIAGNÓSTICO Si aparecen bandas fluorescentes demuestra que la persona presenta la anomalía ¿Hibridación? ¿No hibridación? Renaturalización del ADN con la sonda fluorescente Desnaturalización del ADN ADN de la persona que se quiere diagnosticar

25. Terapia génica, que tiene por objetivo tratar, curar y prevenir enfermedades producidas por un gen defectuoso introduciendo en el paciente un gen terapéutico o funcional.TIPOS.Terapia génica somática, se utiliza un virus para introducir el gen terapéutico Terapia génica de línea germinal. Consiste en introducir células transgénicas de un óvulo fecundado, con el gen terapéutico que trata de corregir defectos en el paciente como en las generaciones futuras.Problemas éticos y eugenesia Ing. Genética. Aplicaciones médicas

26. Para transducir nuevos genes se pueden utilizar diferentes procedimientos: Microinyección de genes. Pistola de genes. Utilización de Agrobacterium tumefaciens. Aplicaciones: Aplicaciones: Resistencia a las heladas, las sequías, exceso de acidez o salinidad del suelo. Retrasar la maduración. Mejorar el valore nutritivo Producir plantas con interés farmacológico Resistencia a plagas o herbicidas Plantas transgénicas

27. Agrobacterium núcleo Plásmido Ti cromosoma inductor de tumores contiene oncogenes (genes onc) cromosoma célula vegetal Ingeniero genético natural tras sutitución de genes onc por genes de interés tumores Proliferación de hormonas crecimiento. Se forman tumores en las zonas de la lesión Aplicaciones de la ingeniería genética en agricultura Plantas transgénicas Agrobacterium tumefaciens es patógena de plantas.Produce tumores Transgénesis= introducción de ADN extraño en un genoma, de modo que se mantenga estable de forma hereditaria y afecte a todas las células en los organismos multicelulares.

28. Aplicaciones de la ingeniería genética en agricultura • Resistencia a herbicidas, insectos y enfermedades microbianas • El maíz transgénico de Novartises resistente al herbicida Basta y también es • resistente al gusano barrenador europeo (contiene el Gen de resistencia a la • toxina Bt de Bacillus thuringiensis)produce su propio insecticida • Problemas:La toxina Bt en las plantas transgénicas tienepropiedades • sustancialmentediferentes a la toxina Bt en su forma natural. • La toxina puede ser transmitida a través de la cadena alimenticia, un • efecto que nunca ha sido observado en la toxina Bt en su forma natural. • Larvas de especies de insectos predadores benéficos (larvas verdes de • crisopa) murieron cuando fueron alimentadas con el gusano barrenador • europeo • Gold rice de Monsanto con color amarillo por los altos niveles de vitamina A • Mejora de la calidad de los productos agrícolas • Producción de aceites modificados • Síntesis de productos de interés comercial • Anticuerpos animales, interferón, e incluso elementos de un poliéster destinado a la fabricación de plásticos biodegradables