Immunoassays http://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/ELISA.html

1. Immunoassayshttp://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/ELISA.htmlImmunoassayshttp://www.sumanasinc.com/webcontent/anisamples/molecularbiology/ELISA.html • Fanden erstmal in den 50er Jahren Verwendung • Zuerst nur radioaktive Markierungen für Immunoassays • Ab den 70er Jahren auch nicht-radioaktive Assays • Klassifizierung der Immunoassays wie folgt: RIA (RadioImmunoAssay) IRMA (ImmunoRadioMetricAssay) FIA (FloureszentImmunoAssay) ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay) EIA (EnzymeImmunoAssay) ELISA (EnzymeLinkedImmunoSorbentAssay)

2. Definition • Antigen • vom Körper als fremd erkannter Stoff, der eine Reaktion des Immunsystems auslöst • Antikörper • die von B-Lymphozyten u. Plasmazellen als Reaktion auf ein Antigen gebildeten Immunglobuline

3. RIA (RadioImmunoAssay) Markiertes Antigen tritt in Kompetition mit unmarkiertem Antigen (zu analysierende Probe) um Bindungsstelle am Antikörper. Signal ist indirekt proportional der Konzentration vom unmarkierten Antigen. FIA (FloureszentImmunoAssay) Analog RIA, aber floureszenzmarkiert. EIA (EnzymeImmunoAssay) Analog RIA, aber enzymmarkiert.

4. IRMA (ImmunoRadioMetricAssay) Markierte Antikörper binden an Antigen, Signal ist damit direkt proportional der Konzentration von Antigen in der zu analysierenden Probe. ILMA (ImmunoLuminoMetricAssay) Analog IRMA, aber luminiszenzmarkiert.

5. ELISA(EmzymeLinkedImmunoSorbentAssay) Durch Festphasenkopplung technisch bedeutend vereinfachter EIA Dient dem Nachweis von Antigenen Antikörpern Haptenen

6. ELISA: Prinzip Sandwich • Festphasen gekoppelter AK (erster AK) • Nachzuweisendes Antigen bindet an diesen 1. AK • Antigen wird mittels Enzym markiertem AK (2. AK) nachgewiesen • Als Enzyme dienen HRP (HorseRadishPeroxidase) Alkalische Phosphatase • Gebundene Enzymaktivität wird über Substratumsatz vermessen • Substrat wird gemeinsam mit löslichem Chromogen angeboten (dieses ist anfänglich farblos und wird durch den Substrat-umsatz zu int. gefärbter, spektroskop. auswertbarer Form) • Direkte Proportionalität zw. unbekannter Probe und Farbumsatz

7. Elisa-Sandwich-Testprinzip

8. Kompetitiver ELISA • Hauptsächlich zum Nachweis von Haptenen wie Steroidhormonen (sind zu klein um zwei AK zu binden) Feste Phase wird/ist mit AK beschichtet Zugabe von Tracer und Hapten (unbekannte Probe) -Tracer = enzymmarkiertes Hapten, wird zu jeder Probe in gleicher Menge beigegeben. -Umso mehr nachzuweisendes Hapten in der Probe ist, umso weniger Tracer wird an die Festphase gebunden (Kompetition). Substratzugabe Tracer setzt Substrat zu Farbstoff um. Umso weniger Tracer umso weniger Farbumsatz, umso mehr Hapten ist in der Probe. • Farbe und Probenmenge sind indirekt proportional!!!! • Nachteil: Überschuß an Tracer wirkt sich negativ auf Empfindlichkeit aus!!

9. Kompetitiver Immunoassay Farbsignal ist indirekt proportional der Antigenkonzentration Meist bei Haptenen verwendet, da diese zu klein sind um zwei Antikörper zu binden Vorsicht: Überschuß an Tracer verfälscht das Ergebnis!!

10. Beispiele • Blut: HIV1 und HIV2 (Anwesenheit von Anti-HIV Antikörper) Hepatitis C (Anwesenheit von Antikörpern) Hepatitis B (Nachweis von Antikörper und viralem Antigen) • Hormone: Schwangerschaftshormon LH (Bestimmung des Eisprungs) TSH, T3 und T4 (Thyroidfunktion) Anabol. Steroide, Sportler: Doping Test • Infektionsdetektion Sexuell übertragbare Erreger (HIV, Syphilis, Chlamydien) Hepatitis B und C Toxoplasmose • Allergene in Lebensmittel und Hausstaub • Rheumatische Faktoren (Autoimmunantikörper) • Toxine im Essen • Drogen: Kokain, Opiate, Marihuana (9-Tatrahydrocannabinol)